专利摘要

本发明涉及糖肽的富集方法，具体地说是一种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖肽的方法；N-连接糖蛋白质经过酶解产生的肽段混合物中加入高碘酸，糖链上的顺式邻二醇经氧化生成醛基，通过反相色谱除盐去除多余的高碘酸；向氧化后的肽段混合物中加入单甲氧基聚乙二醇酰肼（mPEG-Hz），在乙酸－乙酸钠缓冲液中糖肽与聚乙二醇偶联；将反应产物加入超滤离心管样品池中，经过清洗和离心过滤将糖肽和非糖肽分开；糖肽保留在滤膜内，非糖肽离心到滤膜外；向样品池中再加入肽N-糖苷酶F（PNGaseF）的碳酸氢铵缓冲液，酶解后将肽段从其糖基化位点处酶切下来，经过离心即可获得含糖基化位点的肽段。本发明的优点为：是一种普适性的糖肽富集方法，具有较好的选择性，操作步骤简单，非特性吸附的清洗比较容易，成本较低。

说明书

技术领域

本发明涉及糖肽的富集方法，具体地说是一种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖肽的方法，应用于含N-连接糖基化位点的肽段的选择性富集。

背景技术

糖蛋白具有重要的生物功能，但其在生物体内的丰度较低。因此，通常需要经过富集才能对其进行分析。现有的富集方法主要包括凝集素亲和法、硼酸亲和法、亲水相互作用法和糖氧化/酰肼法等。其中凝集素亲和法是一种基于生物亲和的经典方法，具有很高的特异性。但不同类型的凝集素只能专一性的亲和富集一种类型的糖蛋白/糖肽(Yahara，I.and Edelman，G.M.，Proc.Nat.Acad.Sci.，1972，69，608-612)。如要富集不同类型的糖蛋白/糖肽，则需要不同类型的凝集素联用(Jung K.，Cho W.，Regnier F.，J.Proteome Res.，2009，8，643-650)。而其他几种都是普适性的富集方法，对各种糖型具有效果。

糖氧化/酰肼法是目前最广范使用的普适性富集方法。作为一种化学衍生法，已有商品化的酰肼微球可提供用于实验研究。其富集过程为：N-连接糖蛋白的糖链上的顺式邻二醇先经高碘酸氧化成醛；醛基再与固定在基质上的酰肼反应形成共价的腙键，于是糖蛋白便可富集到酰肼微球上，非糖基化蛋白经洗脱去除；糖蛋白再进行固相的酶解，同样通过洗脱去除掉非糖肽；富集的糖肽经PNGase F酶酶解从固相基质上切除下来。Zhang等进一步完善了糖肽的酰肼化学富集，使之成为一套标准方法(Tian Y.，Zhou Y.，et al.，Nat.Protocol.，2007，2：334-339)。

但基于微球的糖氧化/酰肼法操作步骤繁琐，尤其对微球的非特性性吸附的洗脱需要多种试剂多次清洗。并且，由于商品化凝胶基质微球是透明的，在离心后的分离过程中容易损失，影响回收率。因此，我们尝试发展一种新型的基于衍生酰肼的聚乙二醇偶联，结合超滤分离过滤的方法进行糖肽的富集。该方法不仅对糖肽具有特异性，并且操作过程简单，非特性吸附的清洗容易，成本低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种糖肽选择性富集方法，利用该方法富集N-连接糖肽，具备较好的特异性，并且操作步骤比较简单。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

糖肽经过氧化后，糖链上的顺式邻二醇发应生成醛基；再加入单甲氧基聚乙二醇酰肼，使其通过与醛基反应形成共价腙键从而特异性的偶联到糖链上；通过超滤离心分离将非糖肽滤出，与糖肽分离；再向滤膜内样品管中加入糖苷酶将糖链切下，产生的含糖基化位点的肽段经超滤离心分离，即可实现含N-连接糖基化位点的肽段的选择性富集。

具体为：

一种聚乙二醇偶联结合超滤分离富集糖肽的方法，

1)N-连接糖蛋白质经过酶解产生的肽段混合物中加入高碘酸，糖链上的顺式邻二醇经氧化生成醛基，通过反相色谱除盐去除多余的氧化剂；

2)向氧化后的肽段混合物中加入单甲氧基聚乙二醇酰肼，在乙酸-乙酸钠缓冲液中糖肽与聚乙二醇偶联；

糖肽参与偶联反应的是糖链上经氧化产生的醛基；醛基与聚乙二醇上衍生的酰肼基团通过生成共价腙键发生偶联，将单甲氧基聚乙二醇酰肼分子选择性的修饰到糖肽的糖链上；

步骤2)中聚乙二醇偶联反应的具体过程为：将含有1-5mg/mL单甲氧基聚乙二醇酰肼(分子量为10,000-20,000Da)的pH＝4.5-6.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液加入肽段混合物中，在室温下振荡反应6-24小时。

3)将反应产物加入超滤离心管样品池中，经过清洗和离心过滤将糖肽和非糖肽分开；糖肽保留在滤膜内，非糖肽离心到滤膜外；

步骤3)中超滤离心分离的过程为：将步骤2中的反应产物加入滤膜截留分子量为10,000的超滤离心管中，在室温下14,000-16,000g离心15分钟；被滤膜截留的部分再加入超纯水或pH＝7-8碳酸氢铵缓冲液，振荡后在室温下14,000-16,000g离心15-30分钟；如此反复清洗7-9次。

4)向样品池中再加入肽N糖苷酶F的碳酸氢铵缓冲液，酶解后将肽段从其糖基化位点处酶切下来，经过离心即可获得含糖基化位点的肽段。

步骤4)中获得含N-连接糖基化位点的肽段的过程为：向滤膜内含有偶联了聚乙二醇的糖肽样品中加入含肽N-糖苷酶F的pH 7.5-8.5的碳酸氢铵缓冲液，在37℃孵育4-12小时；在室温下14,000-16,000g离心15-30分钟；再向滤膜内样品管中加入pH 7.5-8.5的碳酸氢铵缓冲液，振荡后在室温下14,000-16,000g离心15-30分钟；将两次收取的滤出液收集合并即得到含N-连接糖基化位点的肽段。

本发明聚乙二醇偶联结合超滤离心过滤分离方法对含有N-连接糖基化位点的肽段有特异性富集作用，应用于混合肽段中N-连接糖肽的选择性富集。

本发明的优点为：本发明以单甲氧基聚乙二醇酰肼的酰肼基团与糖肽糖链上氧化产生的醛基共价偶联，结合超滤离心分离的方法即可用于N-连接糖肽的选择性富集。其方法简便，成本低；对N-连接糖肽的选择性好，非特异性吸附的洗脱过程简单。

附图说明

图1聚乙二醇偶联结合超滤离心过滤分离富集糖肽方法的示意图。

图2辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物，经聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽方法处理得到的产物(a)和经商品化糖氧化/酰肼法处理得到的产物(b)MALDI-TOF MS分析得到的质谱图；0.05mg的辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物经过两种富集方法的处理，得到相似的产物质谱图，用聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽方法处理后检测到的含N-连接糖基化位点的肽段数目增加。这说明本发明所开发的富集方法对N-连接糖肽的富集特异性好，可以有效的富集肽段混合物中的N-连接糖肽。

图3辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后产物，经滤膜截留分子量10,000Da的超滤离心管清洗并离心过滤1次(a)和6次(b)MALDI-TOF MS分析得到的质谱图。经过6次过滤分离，可以将酶解产物中绝大部分非糖肽去除，说明本发明所开发的超滤分离方法可以方便的去除非糖肽的干扰，简化富集的步骤。

具体实施方式

本发明糖肽上糖链的氧化可参照文献(Tian Y.，Zhou Y.，et al.，Nat.Protocol.，2007，2：334-339)进行。

具体操作过程为：N-连接糖蛋白质的蛋白酶酶解产物溶于100μL含有高碘酸钠的pH 5-6的缓冲液(其中含有100mM乙酸钠，150mM氯化钠，10mM高碘酸钠)中，在4℃避光反应1小时。产物酸化后上样到用C18捕集柱上，捕集柱用0.1％三氟乙酸冲洗3-10倍柱体积，再用含0.1％三氟乙酸的50％乙腈将保留在捕集柱上的氧化后的糖肽洗脱下来。洗脱液冷冻干燥，-20℃保存。

实施例1

按照如下步骤进行N-连接糖肽的富集。

1)聚乙二醇的偶联反应：将含有1mg/mL单甲氧基聚乙二醇酰肼的100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5，其中含有150mM氯化钠)400μL加入氧化后的肽段混合物中，在室温下反应12小时。即可制备得到聚乙二醇偶联的糖肽。反应实例具体参数如下表1所示。

2)超滤离心分离：含有偶联了聚乙二醇的糖肽和其他非糖肽的水溶液，加入超滤离心管中，滤膜的截留分子量为10,000Da。在室温下1,400g离心15分钟；再向滤膜内样品管中加入400μL水或pH 8.0的100mM碳酸氢铵缓冲液，振荡后，再次在室温下1,400g离心15分钟；重复此清洗过程7-9次。(具体参数如下表1所示)。

表1.聚乙二醇偶联反应和超滤离心分离参数。

具体应用：

富集N-连接糖肽的过程为：0.05mg辣根过氧化物酶经过胰蛋白酶酶解的产物，溶解于pH 5.5的乙酸钠缓冲液中，进行偶联反应并经过超滤离心分离去除非糖肽；再加入100mM pH 8.0的碳酸氢铵缓冲液振荡后离心，反复7次；向滤膜内的样品池中加入含有2μL PNGaseF的pH 8.0碳酸氢铵缓冲液，于37℃孵育12小时；产物经过离心收集滤出液。

由图2可以看出，0.05mg的辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后的产物经过聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集方法处理，和经过商品化糖氧化/酰肼法处理，得到相似的产物质谱图。而且用聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽方法处理后检测到的含N-连接糖基化位点的肽段数目增加。这说明本发明所开发的富集方法对N-连接糖肽的富集特异性与商品化方法相同，可以有效的富集肽段混合物中的N-连接糖肽。

由图3可以看出，辣根过氧化物酶经胰蛋白酶酶解后产物，经过6次过滤分离，就可以将酶解产物中绝大部分非糖肽去除，说明本发明所开发的超滤分离方法可以方便的去除非糖肽的干扰，简化富集的步骤。

本发明的优点为：是一种普适性的糖肽富集方法，具有较好的选择性，操作步骤简单，非特性吸附的清洗比较容易，成本较低。

一种聚乙二醇偶联结合超滤离心分离富集糖肽的方法专利购买费用说明

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