转氨酶突变体及其构建方法和应用

IPC分类号 : C12N9/10,C12N15/54,C12P13/00

申请号

CN201911377567.X

可选规格: 数量

库存1件

确认取消

￥30000; 库存1件

首页

立即咨询

看了又看

专利摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转氨酶突变体及其构建方法和应用。本发明提供的转氨酶突变体包括在野生型转氨酶(WP_0532423951.1)氨基酸序列的第259位、第431位、第264位、第269位及第381位进行单点突变和组合突变的多种突变体，与野生型转氨酶(WP_0532423951.1)相比，该突变体在55℃下半衰期更长，最优组合突变体的半衰期大约是野生型转氨酶(WP_0532423951.1)的5倍，热稳定性更好，适于在较高的温度下催化合成手性胺。通过本发明所提供的构建方法得到的转氨酶突变体在较高的温度下催化合成手性胺时表现出优良的立体选择性和催化活性，具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上进行突变，所述突变位点为A259F、G431T、E264A、A269E、S381E、G431T/E264A、G431T/A269E或A259F/G431T/E264A。

2.一种编码如权利要求1所述的转氨酶突变体的基因。

3.一种包含如权利要求2所述的基因的重组质粒。

4.一种包含如权利要求1所述的转氨酶突变体的固定化酶或工程菌。

5.一种如权利要求1所述的转氨酶突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

在NCBI数据库中搜索SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，删除重复出现的相同序列，选取与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列一致性大于33％的氨基酸序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，将剩余氨基酸序列整理成fasta.文件上传到Consensus Makerv2.0.0服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensussequence，筛选出热稳定性相关的突变位点为：A259F、G431T、E264A、A269E、S381E。

6.如权利要求1所述的转氨酶突变体在催化合成手性胺中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转氨酶突变体及其构建方法和应用。

背景技术

手性胺广泛存在于自然界中，是合成天然产物和手性药物的重要中间体，对手性胺的不对称合成进行深层次研究具有较大的经济效益和应用价值。以糖尿病为例，抗糖尿病的口服药Januvia的主要成分西他列汀为R-型胺，在合成西他列汀工艺中，利用转氨酶催化氨基转移反应生成西他列汀关键中间体的过程是可逆的，通过改变催化反应条件促使氨基和酮基之间的反应平衡向手性胺生成方向移动可提高手性胺合成效率，其理论收率可达100％。

催化手性胺生成的关键酶之一为转氨酶(Transaminase，TA，EC 2.6.1.X)，又称氨基转移酶(Aminotransferase)，主要用于催化氨基和酮基之间的氨基转移。按照底物或产物的不同，转氨酶可分为α-转氨酶和ω-转氨酶，其中α-转氨酶的底物或产物只包括α-氨基酸，而ω-转氨酶的底物和产物包括酮酸、醛和酮，并具有高立体选择性等特点，使得ω-转氨酶在药物合成领域中应用更广泛。在已报道的转氨酶研究中，对于利用蛋白质工程技术开发酶活性较好、底物立体选择性较高的ω-转氨酶突变体研究取得了一定的突破，但大部分ω-转氨酶突变体的热稳定性较差，在55℃保温2小时左右就会出现明显沉淀，从而极大地限制了转氨酶催化手性胺合成在工业上的应用。

常见的蛋白质工程方法包括理性设计(rational design)和非理性设计(irrational design)，其中，理性设计需了解蛋白质的结构和功能，但由于蛋白质结构-功能关系过于庞杂，现今人们仍对其缺乏充足的认识，导致理性设计的准确性偏低；非理性设计的关键瓶颈为高通量筛选，由于建立蛋白质的高通量筛选方法仍然是难题，非理性设计的应用也受到了较大限制。近年来，随着计算机技术和生物信息学技术的发展，MarkusWyss等人提出Consensus Concept理论，不同于以蛋白质结构-功能关系为核心的理性设计，Consensus Concept理论以同源蛋白序列为核心，通过回溯祖先基因及对比同源序列，从进化的角度探寻优化酶热稳定性的方法，如在Consensus Concept理论的指导下得到了具有高热稳定性植酸酶突变体(Biochim Biophys Acta.2000 Dec 29；1543(2):408-415；Protein Eng.2002 May；15(5):403-11.)，此后Consensus Concept理论被广泛用于提升蛋白质热稳定性能的研究中，并已经成功指导了多个蛋白质在热稳定性上的提升优化，为优化蛋白质稳定性的提供了新方法。但目前转氨酶晶体结构尚未得到解析，难以通过蛋白质工程的理性设计进行优化，同时该酶基于Consensus Concept理论的相关研究也未见报道，因此，提升转氨酶或其突变体的热稳定性以打破在催化手性胺合成工业应用的限制成为时下亟待解决的难题。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有的转氨酶热稳定性差的缺陷，从而提供一种热稳定性好的转氨酶突变体、转氨酶突变体的构建方法以及转氨酶突变体在催化手性胺合成中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种转氨酶突变体，所述转氨酶突变体为如下(a1)或(a2)：

(a1)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；

(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.2所示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。

优选地，该转氨酶突变体，SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第259位、第431位、第264位、第269位以及第381位。

进一步优选地，该转氨酶突变体，所述转氨酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上A259F、G431T、E264A、A269E、S381E中任一单点突变位点的单点突变体。

进一步优选地，该转氨酶突变体，所述转氨酶突变体包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列上G431T/E264A、G431T/A269E以及A259F/G431T/E264A中任一组合突变位点的组合突变体。

本发明还提供一种编码如上述转氨酶突变体的基因。

本发明还提供一种包含如上述基因的重组质粒。

本发明还提供一种包含如上述转氨酶突变体的可溶性蛋白、固定化酶或工程菌。

本发明还提供一种如上述转氨酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

在NCBI数据库中搜索SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，删除重复出现的相同序列，选取与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列一致性大于33％的氨基酸序列，然后通过Clustalx1.83软件进行多序列比对，将剩余氨基酸质序列整理成fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence，筛选出热稳定性相关的突变位点为：A259F、G431T、E264A、A269E、S381E。

本发明还提供如上述转氨酶突变体在催化合成手性胺中的应用。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的转氨酶突变体包括单点突变体和组合突变体，与野生型转氨酶(KOF55240.1)相比，其单点突变体和组合突变体在55℃下半衰期均更长；尤其是组合突变体，表现出单点突变体热稳定性的叠加效果，其半衰期大约是野生型转氨酶(KOF55240.1)的5倍。基于此，本发明所提供的转氨酶突变体的热稳定性更好，适于在较高的温度下催化合成手性胺。

2.本发明构建的转氨酶(KOF55240.1)基因工程菌可以高效表达转氨酶突变体，且培养条件简单，培养周期短，表达产物纯化方便等优点。

3.本发明提供的转氨酶突变体的构建方法，与理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，本发明基于Consensus Concept理论，通过构建数据库，利用生物信息技术进行检索，筛选和比对同源性序列，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息，对转氨酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型转氨酶突变体。

4.本发明提供的转氨酶酶突变体在应用于催化合成手性胺时具有优良的立体选择性、区域选择性和催化活性，具有较好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例4提供的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白模拟晶体结构示意图及突变位点在晶体结构上的分布示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明的目的、技术方案和要点，下面将对本发明的实施方式作进一步详细描述。本发明可以多种不同的形式实施，而不应该被理解为仅限于在此阐述的实施例。相反，提供此实施例，使得本发明将是彻底的和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。

本发明所涉及生物材料的来源的一般性说明：

1.基因及引物：本发明中所使用的优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)基因及所有引物均由生工生物技术公司合成制备；

2.其它生物材料；

pET28a质粒载体购自Novagen；

T4 DNA连接酶购自NewEngland Biolabs；

PrimeSTAR Max Premix高保真酶、buffer购自TakaRa；

DpnI酶、DreamTaq DNA聚合酶以及所有限制性内切酶均购自Thermo；

PrimeSTAR Max聚合酶购自Takara；

DNA胶回收试剂盒及小质粒提试剂盒购自天根生化科技有限公司。

实施例1

本实施例提供一种转氨酶突变体，该转氨酶突变体是在野生型转氨酶(KOF55240.1)的氨基酸序列基础上经分子改造的衍生蛋白，其中，野生型转氨酶(KOF55240.1)由源于无色杆菌(Achromobacter sp.DMS1)菌株的天冬氨酸氨基转氨酶(天冬氨酸转氨酶为ω转氨酶家族一员)基因经过密码子优化后表达得到的蛋白，编码该蛋白的核酸序列为SEQ ID NO.1，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

本实施例提供的转氨酶突变体包括：

(a1)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；或，

(a2)通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.2所示的蛋白表现出至少92％同源性的衍生蛋白。

具体地，在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列选择某一个位点进行突变，可得到多种单点突变体，依次进行活力测试，筛选出热稳定性及活性提高的单点突变体，其单点突变位点为：第259位、第431位、第264位、第269位以及第381位，对应5种转氨酶单点突变体：

(1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第259位酪氨酸被苯丙氨酸取代，记为A259F；

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第431位甘氨酸被苏氨酸取代，记为G431T；

(3)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第264位谷氨酸被丙氨酸取代，记为E264A；

(4)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第269位丙氨酸被谷氨酸取代，记为A269E；

(5)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第381位丝氨酸被谷氨酸取代，记为S381E。

或者，在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合，如从上述5个突变位点中选择2个突变位点进行组合，分别得到以下10种转氨酶组合突变体，其组合突变位点为：A259F/G431T、A259F/E264A、A259F/A269E、A259F/S381E、G431T/E264A、G431T/A269A、G431T/S381E、E264A/A269E、E264A/S381E、A269E/S381E；如从上述5个突变位点中选择3个突变位点进行组合，分别得到10种转氨酶组合突变体，其组合突变位点为：A259F/G431T/E264A、A259F/G431T/A269E、A259F/G431T/S381E、A259F/E264A/A269E、A259F/E264A/S381E、A259F/A269E/S381E、G431T/E264A/A269E、G431T/E264A/S381E、G431T/A269E/S381E、E264A/A269E/S381E；如从上述5个突变位点中选择4个突变位点进行组合，分别得到5种转氨酶组合突变体，其组合突变位点为：A259F/G431T/E264A/A269E、A259F/E264A/A269E/S381E、A259F/G431T/A269E/S381E、A259F/G431T/E264A/S381E、G431T/E264A/A269E/S381E；如上述5个突变位点中选择5个突变位点进行组合，得到1种转氨酶组合突变体，其组合突变位点为：A259F/G431T/E264A/A269E/S381E。将上述得到的多种组合突变体分别进行活力测试，筛选出3种热稳定性及活性提高的组合突变体，其突变位点为G431T/E264A、G431T/A269E以及A259F/G431T/E264A。

实施例2

本实施例提供一种编码如实施例1所述的转氨酶突变体的基因：

(1)编码突变位点为A259F的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.3；

(2)编码突变位点为G431T的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.4；

(3)编码突变位点为E264A的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.5；

(4)编码突变位点为A269E的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.6；

(5)编码突变位点为S381E的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.7；

(6)编码突变位点为G431T/E264A的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.8；

(7)编码突变位点为G431T/A269E的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ ID NO.9；

(8)编码突变位点为A259F/G431T/E264A的转氨酶突变体的核酸序列为SEQ IDNO.10。

实施例3

本实施例提供一种包含实施例2提供的基因的重组质粒，为可以用于将转氨酶基因整合到宿主细胞上进行稳定表达的质粒载体，如pET28a、pUC18、pUC19、pET15b等；宿主细胞可选择革兰氏隐形细菌(如大肠杆菌)、革兰氏阳性细菌(如枯草芽孢杆菌)、真菌(如曲霉菌)、酵母(如酿酒酵母)、放线菌(如链霉菌)等，均可以用来表达转氨酶突变体蛋白。

实施例4

本实施例提供一种转氨酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

1.野生型转氨酶(KOF55240.1)基因的克隆

将野生型转氨酶(KOF55240.1)基因以大肠杆菌为感受态宿主细胞进行密码子优化，得到优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)基因，其核酸序列为SEQ ID NO.1，所表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.2；以SEQ ID NO.1作为目的基因，采用上游扩增引物SEQ ID NO.11和下游扩增引物SEQ ID NO.12扩增目的基因；

SEQ ID NO.11核苷酸序列为：

5’-TACCAGACGACGAcatTTTGACGGCCTGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点)；

SEQ ID NO.12核苷酸序列为：

5’-CTTCCATAGCCAAggatccTTCAAGACTTTCTTCAACGA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)。

扩增条件为：使用PrimeSTAR Max聚合酶，在98℃下扩增3min，然后在98℃下扩增10sec、在55℃下扩增10sec、在72℃下扩增15sec，共30个循环，最后在72℃下扩增10min。

待反应结束，采用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，得到1.0kb大小的条带，与符合预期结果相符。采用DpnI酶消化模板，回收、纯化该目的片段，并采用限制性内切酶NdeI和BamHI分别对目的片段以及pET28a质粒载体进行双酶切，然后通过T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)电转化感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有40μg/mL卡那霉素的固体培养基上以筛选出阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)基因序列正确，且已正确连入pET28a质粒载体中，得到重组质粒pET28a-KOF55240.1。

2.优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白的表达和纯化

将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100μg/mL卡那霉素(Kan+)的4mL LB液体培养基试管中，在37℃、230rpm下培养11h；然后将该4mL菌液转接至含50μg/mL卡那霉素(Kan+)的LB液体培养基的1L摇瓶中，在37℃、230rpm下培养约2h，使OD600达到0.8左右；再加入0.1mM IPTG诱导剂，在25℃、200rpm下诱导培养11-17h，本实施例中诱导培养14h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液离心，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理，得到纯度＞95％的优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白。

3.优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)大容量随机突变库的构建

通过连续易错PCR(ep-PCR)方法构建优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)的突变库，并通过调节PCR体系中的镁离子的浓度来调节突变率。

易错PCR体系包括：

DreamTaqTM(0.05U/μL)及其buffer，dATP(250μM)，dGTP(250μM)，dCTP(1050μM)，dTTP(1050μM)；

优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)上游引物(0.4μM)，优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)下游引物(0.4μM)，优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)；

pET-28a质粒载体(0.2ng/μL)，氯化镁(0.3～0.9mM)；

其中，优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)上游引物序列为SEQ ID NO.11，下游引物序列为SEQ ID NO.12。

将易错PCR体系分装为25μL/管进行易错PCR扩增，扩增条件为：

在95℃下扩增3min，共1个循环；在95℃下扩增10sec、在55℃下扩增35sec、在72℃下扩增1min，共30个循环；在72℃下扩增6min，共1个循环。待反应结束，用NdeI和BamHIII进行双酶切割纯化的突变后目的片段，然后采用T4 DNA连接酶克隆到pET28a质粒载体上，再将纯化后的质粒载体体系电转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞宿主中，待转化细胞经复苏后接种到50mL的LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养过夜，取培养液提取质粒，得到突变库质粒，取样涂布卡纳霉素抗性的琼脂糖平板上，计算库容量约为100万个；取若干克隆测定突变率，发现镁离子浓度为0.7mM时，获得突变率大约为平均每个基因1.5个突变氨基酸残基。突变基因库的质粒转化电转化感受态宿主大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，经LB液体培养基培养、诱导、表达后进行筛选。

4.优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)同源蛋白的多序列比对及Consensus分析

(1)进入Pfam数据库主页(http://pfam.xfam.org/)，在SEQUENCE SEARCH工具中输入优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)的氨基酸序列SEQ ID NO.2进行搜索，服务器直接反馈该蛋白整个家族的氨基酸序列比对结果。本实施例中为天冬氨酸氨基转氨酶家族，以柱状图的形式显示各个突变位点的各类氨基酸丰度，同时，Pfam数据库主页也可以自动生成优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白家族的consensus sequence。

(2)进入NCBI蛋白质数据库中，输入优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)的氨基酸序列SEQ ID NO.2，利用Blast工具，找出所有与该氨基酸序列SEQ ID NO.2一致性大于33％的蛋白质序列，删除重复出现的相同序列，将剩余氨基酸序列整理成fasta.格式，用Clustalx1.83软件实现多序列比对，比对结果以fasta.、aln.和dnd.格式输出；将所下载的fasta.文件上传到Weblogo 3(http://weblogo.threeplusone.com/)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将以柱状图形式展示多序列比对结果中蛋白质序列各个突变位点的氨基酸丰度。

将上述fasta.文件上传到Consensus Maker v2.0.0(http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html)服务器，根据需要修改设置参数后，该在线软件将生成可以后期编辑的consensus sequence。

(3)将优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)的氨基酸序列SEQ ID NO.2与该家族consensus sequence以及各突变位点氨基酸丰度图进行对照比较。

5.优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白晶体结构解析及突变热点的选择

(1)对获得的优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白晶体通过X-ray衍射的方法对其结构进行解析。

(2)用PyMOL软件观测优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白晶体结构，根据结构信息复查上述待选突变位点及突变形式，筛选出最有可能提高优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白热稳定性的突变体，筛选条件如下：

A.判断某一突变位点为待选突变位点的标准为：①在该突变位点处氨基酸丰度目的酶家族大多数蛋白总体高度较高；②该突变位点氨基酸为保守型氨基酸；③该突变位点出现频率较高的氨基酸与优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白晶体该突变位点处的氨基酸有较大的理化性质差异，包括极性强弱、电荷差异及空间位阻大小等性质；

B.除去活性中心附近，除去处于包埋或半包埋状态的氨基酸残基。

经过A、B两步筛选，此时共剩余58个差异位点，大多数位于蛋白分子的表面，如图1所示。

C.根据优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白晶体结构，逐个详细分析上述58种突变形式，筛选出可能提高优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)蛋白热稳定性的突变体。

主要判断准则为：①在该突变位点的突变应消除原有的不利于热稳定的作用力形式，如静电排斥作用力等；②在该突变位点的突变不应破坏现有的稳定的蛋白结构；③在该突变位点的突变应引入新的有利于热稳定的作用力形式，如氢键的添加、盐桥的搭建、疏水基团相互作用等。

共设计单点突变体5种，其单点突变位点分别为：A259F、G431T、E264A、A269E和S381E，这5种突变体全部通过结构辅助的Consensus Concept方法设计获得。

使用与单点突变体相似的构建方法，将热稳定性提高的单点突变体累加组合，在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列选择多个突变位点进行组合，如从上述5个位点中选择2～5个位点进行突变，分别得到不同的转氨酶组合突变体：

(1)选择2个突变位点进行组合，可构建10种转氨酶组合突变体：

A259F/G431T、A259F/E264A、A259F/A269E、A259F/S381E、G431T/E264A、G431T/A269A、G431T/S381E、E264A/A269E、E264A/S381E、A269E/S381E；

(2)选择3个突变位点进行组合，可构建10种转氨酶组合突变体：

A259F/G431T/E264A、A259F/G431T/A269E、A259F/G431T/S381E、A259F/E264A/A269E、A259F/E264A/S381E、A259F/A269E/S381E、G431T/E264A/A269E、G431T/E264A/S381E、G431T/A269E/S381E、E264A/A269E/S381E；

(3)选择4个突变位点进行组合，可得到5种转氨酶组合突变体：

A259F/G431T/E264A/A269E、A259F/E264A/A269E/S381E、A259F/G431T/A269E/S381E、A259F/G431T/E264A/S381E、G431T/E264A/A269E/S381E；

(4)选择5个突变位点进行组合，可得到1种转氨酶组合突变体：

A259F/G431T/E264A/A269E/S381E。

将得到的单点突变体和组合突变体分别进行活力测定，选出热稳定性和活性提高的5种单点突变体和3种组合突变体，其突变位点如下：

A259F、G431T、E264A、A269E、S381E、G431T/E264A、G431T/A269E以及A259F/G431T/E264A。

测试例1

1.转氨酶突变体的性质表征

将优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)以及实施例4提供的多种转氨酶突变体进行热稳定性测试，按照常规转氨酶活力测定方法(参见文献Arch Biochem Biophys.2000,373(1):182-92)，具体为：

取优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)及实施例4提供的多种转氨酶突变体各0.225mg/ml分别溶于于30mM(pH＝7.2)磷酸盐缓冲液中，置于55℃水浴锅中水浴加热。以加热0时为起点，通过紫外分光光度计测定酶在55℃水浴加热不同时长后的残余酶活力。以残存酶活力到达为初始酶活力一半值时的55℃水浴时间为其55℃半衰期值。

实验结果表明，上述5种单点突变体和3种组合突变体的热稳定性得到明显改善，如表1所示：

表1.野生型转氨酶(KOF55240.1)、单点突变体和组合突变体的酶学性质表征

由表1得知，本发明提供的转氨酶突变体包括单点突变体和组合突变体，通过测定优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)、转氨酶突变体的55℃半衰期发现，与优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)相比，转氨酶突变体在55℃的热稳定性得到了明显的提高；其中，最优组合突变体(突变位点为A259F/G431T/E264A)在55℃热稳定性大约是优化的野生型转氨酶(KOF55240.1)5倍。基于此，本发明所提供的转氨酶突变体适于在较高的温度下催化合成手性胺，优化药物和农业的工业生产工艺。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

发明名称：转氨酶突变体及其构建方法和应用

SEQ ID NO.1：

1 ATGTCTGCTGCCAAATTACCTGATTTGTCCCATCTTTGGATGCCCTTTACTGCAAATCGT

61 CAATTCAAGGCGAACCCACGCCTCCTAGCTTCAGCCAAAGGTATGTATTACACCTCGTTT

121 GACGGCCGACAGATTCTGGATGGAACAGCAGGGTTATGGTGTGTTAATGCGGGTCACTGC

181 CGGGAAGAGATCGTCAGTGCTATAGCCAGCCAAGCAGGCGTAATGGACTATGCGCCGGGA

241 TTCCAGTTGGGGCATCCTCTTGCTTTTGAAGCCGCAACGGCGGTGGCTGGTCTCATGCCC

301 CAAGGCCTAGATAGAGTTTTCTTTACTAACTCTGGATCCGAGTCAGTCGACACCGCCCTG

361 AAGATTGCATTAGCGTACCACAGGGCTCGTGGGGAAGCCCAGCGCACACGATTGATCGGT

421 CGGGAGAGAGGCTATCATGGAGTAGGGTTCGGTGGCATATCGGTGGGAGGGATTAGTCCA

481 AATAGGAAAACGTTTAGCGGTGCACTTCTCCCGGCGGTTGATCACCTACCTCATACTCAC

541 TCTCTGGAACATAACGCTTTCACCCGTGGCCAACCCGAGTGGGGAGCCCACTTAGCAGAC

601 GAATTGGAGCGCATCATAGCGCTTCATGATGCTTCCACAATTGCCGCAGTCATCGTAGAA

661 CCAATGGCGGGGTCAACGGGTGTGCTCGTTCCGCCTAAGGGCTACCTAGAGAAACTGCGA

721 GAAATAACTGCTCGGCACGGAATTTTATTGATCTTTGACGAGGTCATAACCGCCTATGGG

781 AGACTTGGTGAAGCAACAGCGGCTGCCTACTTCGGCGTAACGCCCGATCTCATTACTATG

841 GCAAAGGGAGTGTCGAATGCGGCTGTTCCAGCCGGGGCAGTCGCGGTAAGGCGTGAGGTG

901 CATGACGCTATCGTTAACGGTCCGCAGGGCGGAATAGAATTTTTCCACGGGTATACCTAC

961 AGTGCCCATCCTCTAGCAGCGGCTGCCGTCCTGGCAACATTAGATATTTATCGCCGAGAG

1021 GACTTGTTTGCGCGGGCTAGAAAACTTAGCGCCCCCTTCGAAGAGGCAGCGCACTCTCTC

1081 AAGGGTGCTCCACATGTAATCGATGTGAGGAATATAGGCCTAGTTGCCGGAATTGAACTG

1141 TCCCCGCGTGAGGGGGCACCTGGTGCGCGCGCTGCCGAAGCATTTCAAAAATGTTTCGAC

1201 ACGGGCTTAATGGTCCGATACACTGGAGATATCTTGGCGGTATCACCCCCACTTATAGTG

1261 GACGAGAACCAGATTGGGCAAATCTTTGAAGGTATAGGCAAGGTTCTCAAAGAGGTCGCT

SEQ ID NO.2：

MSAAKLPDLSHLWMPFTANRQFKANPRLLASAKGMYYTSFDGRQILDGTA 50

GLWCVNAGHCREEIVSAIASQAGVMDYAPGFQLGHPLAFEAATAVAGLMP 100

QGLDRVFFTNSGSESVDTALKIALAYHRARGEAQRTRLIGRERGYHGVGF 150

GGISVGGISPNRKTFSGALLPAVDHLPHTHSLEHNAFTRGQPEWGAHLAD 200

ELERIIALHDASTIAAVIVEPMAGSTGVLVPPKGYLEKLREITARHGILL 250

IFDEVITAYGRLGEATAAAYFGVTPDLITMAKGVSNAAVPAGAVAVRREV 300

HDAIVNGPQGGIEFFHGYTYSAHPLAAAAVLATLDIYRREDLFARARKLS 350

APFEEAAHSLKGAPHVIDVRNIGLVAGIELSPREGAPGARAAEAFQKCFD 400

TGLMVRYTGDILAVSPPLIVDENQIGQIFEGIGKVLKEVA

SEQ ID NO.3：