专利摘要

本发明公开了一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，包括内核，二氧化硅壳层和聚苯乙烯壳层；内核为稀土发光纳米颗粒，二氧化硅壳层包覆于所述内核外，并且二氧化硅壳层修饰有双键；聚苯乙烯壳层包覆于二氧化硅壳层外，并且聚苯乙烯壳层修饰有功能化基团。并且公开了含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法。本发明含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料分散性好、稳定性强，可应用于生物偶联、免疫层析检测、疏水分子或纳米颗粒包埋。

权利要求

1.一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，其特征在于，

所述含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，包括内核，二氧化硅壳层和聚苯乙烯壳层；所述内核为稀土发光纳米颗粒，所述二氧化硅壳层包覆于所述内核外，并且所述二氧化硅壳层修饰有双键；所述聚苯乙烯壳层包覆于所述二氧化硅壳层外，并且所述聚苯乙烯壳层修饰有功能化基团；

所述含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料直径为100-1000nm；所述聚苯乙烯壳层表面到所述内核表面的最大距离为50-500nm；所述功能化基团为羧基、氨基或醛基，并且所述功能化基团的浓度为6-42nmol/mg含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料；

制备方法包括如下步骤：

(1)通过正硅酸乙酯TEOS的水解在稀土发光纳米颗粒RENPs表面形成二氧化硅壳层；通过3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷MPS的水解在二氧化硅壳层上修饰双键，得到的材料记为RENPs@SiO2-MPS；

(2)使用苯乙烯单体和含有羧基的单体在RENPs@SiO2-MPS表面聚合形成具有羧基的聚苯乙烯壳层，得到的羧基功能化材料记为RENPs@SiO2@PS-COOH；

所述步骤(2)具体步骤如下：

将RENPs@SiO2-MPS加入到乙醇和水混合溶液中，按照0.1-1.0mL/30mg RENPs@SiO2-MPS加入苯乙烯单体；在搅拌状态下通氮气除氧气，升温至70-80℃，注入引发剂，进行聚合反应；

维持反应温度70-80℃，按照苯乙烯单体质量10-40％向聚合反应体系加入含有羧基的单体，并加入交联剂，反应3-24h后，停止加热，自然冷却至室温；产物离心，洗涤沉淀，得到羧基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-COOH。

2.根据权利要求1所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，其特征在于，

所述引发剂包括过硫酸钾；

所述含有羧基的单体包括丙烯酸、衣康酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或马来酸酐；

所述交联剂包括二乙烯基苯。

3.根据权利要求1所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，其特征在于，通过小分子偶联反应将RENPs@SiO2@PS-COOH的羧基转换为氨基或醛基。

4.根据权利要求1所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，其特征在于，还包括步骤(5)：

通过乙二胺与羧基的偶联反应将RENPs@SiO2@PS-COOH转换为氨基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-NH2。

5.根据权利要求4所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，其特征在于，还包括步骤(6)：

通过戊二醛与氨基的偶联反应将RENPs@SiO2@PS-NH2转换为醛基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-CHO。

6.权利要求1-5任意一项方法制备获得的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料。

7.根据权利要求6所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，其特征在于，所述稀土发光纳米颗粒包括掺杂一种或多种镧系离子的无机基质。

8.利用权利要求6或7所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料表面的羧基、氨基或醛基与抗体进行生物偶联在免疫层析技术中的应用。

9.根据权利要求6或7任意一项所述的一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料在进行生物偶联、免疫层析检测、疏水分子或纳米颗粒包埋中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于稀土发光纳米材料技术领域，具体涉及一种含聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料及其生物偶联和应用。

背景技术

稀土纳米材料的光稳定性和化学稳定性良好，具有广泛的应用前景。常用的稀土纳米材料都是在油酸-十八烯混合溶剂中获得的，但其表面的油酸配体使得材料不溶于水且难进行表面官能化，大大限制了其在生物医学领域的应用。

目前稀土纳米材料大多数通过非共价键的形式进行表面官能化修饰，例如亲疏水相互作用、静电吸附作用等。F.Xu等人用聚丙烯酸(PAA)对稀土纳米材料进行表面修饰，通过PAA与油酸配体交换使稀土纳米材料表面接枝上大量羧基官能团，修饰后的材料具有较好的水溶性，可直接用于抗体的生物偶联(ACS Nano 2017,11,6261-6270.)。同样的，Dayong Jin等人用羧基聚乙二醇((polyethylene glycol modified with a carboxygroup,cPEG,Mw＝3500)也能在稀土纳米材料表面修饰上羧基(Anal.Chem.2018,90,12356-12360.)。然而上述方法的不足之处在于：第一，配体交换容易导致纳米颗粒之间发生聚集；第二，亲水配体与纳米颗粒的结合作用力为非共价键，这种作用力比共价作用弱很多，且容易受到溶液中干扰物质的影响而断开，因此在复杂体系中颗粒表面的抗体随时可能脱落。

另外，Hans H.Gorris等人在包裹了硅层的稀土纳米材料中加入羧基乙基硅烷三醇钠盐(Sodium Carboxyethylsilanetriol)，直接在材料表面修饰上羧基官能团(Anal.Chem.2016,88,6011-6017.)。但是由于二氧化硅是由硅羟基发生缩合反应形成硅氧键得到的，长期存放于纯水中会发生硅氧键断裂从而逐渐溶解，因此稳定性难以保证。

有文献报道，在聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的辅助下通过种子聚合反应可以在稀土纳米材料表面生长一层厚度为10nm的聚苯乙烯壳，由于聚苯乙烯的表面吸附有PVP配体，在PVP的位阻效应下，被包裹后的稀土纳米材料在纯水中分散性良好；然而该材料仍无法进行生物偶联；并且吸附在聚苯乙烯表面的PVP经过多次洗涤后会逐渐脱落，材料的分散性变差；聚苯乙烯壳层较薄，对内核材料的悬浮能力不够，且溶液中的离子容易扩散到内核，可能对稀土纳米材料造成腐蚀溶解。

因此，如何提供一种经表面功能化修饰并且不易团聚、稳定性强的稀土纳米材料是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，其分散性佳、稳定性强，能够与抗体形成稳定的复合物，且更加适用于免疫层析应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，包括内核，二氧化硅壳层和聚苯乙烯壳层；内核为稀土发光纳米颗粒，二氧化硅壳层包覆于内核外，并且二氧化硅壳层修饰有双键；聚苯乙烯壳层包覆于二氧化硅壳层外，并且聚苯乙烯壳层修饰有功能化基团。

包裹二氧化硅壳层即在稀土发光纳米颗粒的表面引入双键，便于苯乙烯聚合后形成的低聚物优先沉积在稀土发光纳米颗粒的表面，从而实现聚苯乙烯壳层的生长，确保壳层结构的稳定性。功能化修饰的聚苯乙烯壳包覆于二氧化硅壳层外，保证了稀土纳米材料良好的分散性、均一性和长期稳定性；可阻隔内层材料与溶剂的接触，防止内层材料腐蚀、分解；另一方面完成了稀土纳米材料的表面功能化，从而可以与蛋白或核酸等生物大分子进行生物偶联，并应用于免疫层析检测技术。

优选地，含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料直径为100-1000nm；聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离为50-500nm；功能化基团为羧基、氨基或醛基，并且功能化基团的浓度为6-42nmol/mg含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料。

聚苯乙烯壳层厚度在50-500nm之间，壳层较厚，为稀土发光纳米颗粒提供了较强的悬浮力，在无PVP位阻效应的作用下，仍然能保证非常好的分散性和稳定性。

进一步优选地，聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离为50-200nm。

进一步优选地，功能化基团的浓度为3-10μmol/mmol含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料。

进一步优选地，含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料直径为100-200nm；聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离为50-100nm。

优选地，稀土发光纳米颗粒包括掺杂一种或多种镧系离子的无机基质。

进一步优选地，无机基质可选用NaLnF4，LiLnF4，Ln(OH)3，Ln2O3，LnF3，LnVO4，LnPO4等，Ln为镧系元素。

进一步优选地，稀土发光纳米颗粒无机基质外还可包覆有一层或多层无机壳层，无机壳层可选用NaLnF4、LiLnF4、CaF2等，Ln为镧系元素。

稀土发光纳米颗粒的发光性质可以是以下任意一种：

(1)长波长激发、短波长发射的上转换发光；

(2)激发光和发射光皆位于近红外区域(700-1700nm)，且激发光波长小于等于发射光波长。

一种含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)通过正硅酸乙酯TEOS的水解在稀土发光纳米颗粒RENPs表面形成二氧化硅壳层；通过3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷MPS的水解在二氧化硅壳层上修饰双键，得到的材料记为RENPs@SiO2-MPS；

(2)使用苯乙烯单体和含有羧基的单体在RENPs@SiO2-MPS表面聚合形成具有羧基的聚苯乙烯壳层，得到的羧基功能化材料记为RENPs@SiO2@PS-COOH。

优选地，步骤(2)具体步骤如下：

将RENPs@SiO2-MPS加入到乙醇和水混合溶液中，按照0.1-1.0mL/30mg RENPs@SiO2-MPS加入苯乙烯单体；在搅拌状态下通氮气除氧气，升温至70-80℃，注入引发剂，进行聚合反应；

维持反应温度70-80℃，按照苯乙烯单体质量10-40％向聚合反应体系加入含有羧基的单体，并加入交联剂，反应3-24h后，停止加热，自然冷却至室温；产物离心，洗涤沉淀，得到羧基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-COOH。

优选地，含有羧基的单体用量为苯乙烯单体质量的30％。

优选地，加入含有羧基的单体和交联剂后聚合反应时间为3-12h。

进一步优选地，加入含有羧基的单体和交联剂后聚合反应时间为9h。

优选地，引发剂包括过硫酸钾；

含有羧基的单体包括丙烯酸、衣康酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或马来酸酐；

交联剂包括二乙烯基苯。

进一步优选地，含有羧基的单体为丙烯酸。

优选地，可通过小分子偶联反应将RENPs@SiO2@PS-COOH的羧基转换为氨基或醛基。

优选地，上述制备方法还包括步骤(5)：

通过乙二胺与羧基的偶联反应将RENPs@SiO2@PS-COOH转换为氨基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-NH2。

优选地，上述制备方法还包括步骤(6)：

通过戊二醛与氨基的偶联反应将RENPs@SiO2@PS-NH2转换为醛基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-CHO。

上述含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料在进行生物偶联、免疫层析检测、疏水分子或纳米颗粒包埋中的应用。

优选地，含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料与特异性抗体进行生物偶联，作为抗体标记物应用于免疫层析检测技术中。

进一步优选地，含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的生物偶联和免疫层析应用过程具体如下：

(1)生物偶联：取含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料，加缓冲液离心，沉淀分散于缓冲溶液中；加入功能化基团偶联催化剂，加入抗体，室温下反应3-24h，之后加入封闭剂进行封闭；离心，分散于缓冲溶液中，4℃保存。

(2)硝基纤维素膜的处理和蛋白的固定：将硝基纤维素膜粘贴在PVC底板中央，将T线(检测线)和C线(质控线)的抗体稀释至一定浓度，用划膜仪将抗体划到硝基纤维素膜上进行包被，划好的硝基纤维素膜放置在37℃烘箱处理3-24h。

(3)试纸条的组装：取出固定好抗体的硝基纤维素膜，在PVC底板的两端粘贴样品垫和吸水垫，分别与硝基纤维素膜重叠1mm，即组装成试纸板。用自动切膜机将组装好的试纸板切割成3.9mm宽的小条，将小条装载于塑料外壳内，得到免疫层析试纸条。

(4)样品的测试和结果的判读：待测抗原使用样品稀释液稀释，加入含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料标记的抗体溶液，充分混匀后，取50-200μL加入到试纸条的样品垫上，反应5-20min后进行读数。

优选地，聚苯乙烯壳层中可包埋疏水性较强的小分子或者小尺寸的纳米颗粒，例如有机染料、量子点、药物分子等。

综上所述，本发明通过两步分散聚合的方法完成了含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的表面功能化，功能化基团连接稳定性强，且材料分散性佳，适于广泛的实际应用。

附图说明

图1.实施例1中β-NaYF4:Yb,Er内核的透射电镜照片。

图2.实施例2中β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核的透射电镜照片。

图3.实施例1和实施例2内核的荧光发射光谱。

图4.实施例3中α-NaYF4:Yb,Nd内核的透射电镜照片。

图5.实施例4中α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核的透射电镜照片。

图6.实施例3和实施例4内核的发射光谱图。

图7.实施例5中的水溶性NaYF4:Nd内核的透射电镜照片。

图8.实施例5中的水溶性NaYF4:Nd内核的发射光谱图。

图9.实施例6中利用反相微乳法合成的RENPs@SiO2-MPS的透射电镜照片。

图10.实施例7中利用Stober法合成的RENPs@SiO2-MPS的透射电镜照片。

图11.实施例8中RENPs@SiO2@PS-COOH材料复合材料的合成路径示意图。

图12.实施例8中由丙烯酸单体共聚得到的RENPs@PS&AA的透射电镜照片。

图13.实施例8中RENPs@PS&AA在pH＝7.4的缓冲溶液中的表面电位分布。

图14.实施例8中RENPs@PS&AA红外光谱图。

图15.实施例9中由衣康酸单体共聚得到的RENPs@PS&IA的透射电镜照片。

图16.实施例9中RENPs@PS&IA在pH＝7.4的缓冲溶液中的表面电位分布。

图17.实施例10中由甲基丙烯酸共聚得到的RENPs@PS&MA的透射电镜照片。

图18.实施例10中，RENPs@PS&MA在pH＝7.4的缓冲溶液中的表面电位分布。

图19.实施例11中由马来酸酐共聚得到的RENPs@PS&MAH的透射电镜照片。

图20.实施例11中RENPs@PS&MAH在pH＝7.4的缓冲溶液中的表面电位分布。

图21.实施例15中染料Rh760负载前后的荧光发射光谱。

图22.实施例16中RENPs@PS&AA偶联抗体后，进行甲胎蛋白免疫层析检测的试纸条照片。

图23.实施例16中RENPs@PS&AA偶联抗体后，进行甲胎蛋白免疫层析检测的标准样品检测曲线。

图24.实施例17中RENPs@SiO2@PS-NH2偶联抗体后，进行甲胎蛋白免疫层析检测的试纸条照片。

图25.实施例17中RENPs@SiO2@PS-NH2偶联抗体后，进行甲胎蛋白免疫层析检测的标准样品检测结果。

图26.实施例18中RENPs@PS&AA材料在室温下放置30天的水合粒径变化。

图27.实施例18中RENPs@PS&AA的PDI(多分布系数)随放置时间的变化。

图28.实施例18中RENPs@PS&AA在pH＝7.4缓冲溶液中的表面电位随放置时间的变化。

图29.实施例18中RENPs@PS&AA偶联抗体后在37℃恒温箱中放置0、2、4、6、8天后用于检测甲胎蛋白(浓度为270ng/mL)；图中显示的是试纸条的照片。

图30.实施例18中RENPs@PS&AA偶联抗体后在37℃恒温箱中放置0、2、4、6、8天后用于检测甲胎蛋白的免疫层析工检测曲线；图中百分数表示CV值偏差。

图31.实施例19中，RENPs@PS&AA和RENPs@PAA的水合粒径分布。

图32.实施例19中，RENPs@PS&AA和RENPs@PAA偶联抗体后放置第0天和第30天后，免疫层析的成像结果对比。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：β-NaYF4:Yb,Er内核的合成及发光性质研究

将YCl3 0.78mmol，YbCl3 0.2mmol，ErCl3 0.02mmol，OA(oleic acid油酸)6mL和ODE(1-Octadecene十八烯)15mL加入到100mL圆底烧瓶中，真空加热至150℃直至所有稀土氯化物溶解，自然冷却至60℃。

向冷却后的体系中逐滴加入含有2.5mmol NaOH和4mmol NH4F的甲醇溶液10mL，搅拌30分钟。搅拌后体系加热至150℃，通氮气1h以除去甲醇。

氮气保护下，反应体系加热至300℃，反应1h；待反应完成后，自然冷却至室温。

向反应产物加入10mL乙醇，15000rpm离心10min，弃去上清溶液；将所得固体分散在10mL环己烷中，加入20mL乙醇，离心分离，最终将所得β-NaYF4:Yb,Er内核分散在10mL环己烷中。

对β-NaYF4:Yb,Er内核进行透射电镜表征，结果如图1所示，β-NaYF4:Yb,Er内核为均一的球形，尺寸(直径)约为27nm。

对β-NaYF4:Yb,Er内核进行光谱表征，结果如图3所示，在980nm激发下，β-NaYF4:Yb,Er内核在540nm、660nm均有发射峰，表现为特征的上转换发光性质。

实施例2：β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核的合成及发光性质研究

将LuCl3 1mmol，OA 6mL和ODE 15mL加入到100mL圆底烧瓶中，真空加热到150℃至所有稀土氯化物溶解，自然冷却至90℃。

向冷却后的体系中加入含有200mgβ-NaYF4:Yb,Er内核(实施例1)的环己烷溶液10mL，加热至150℃，通氮气1h以除去环己烷。

环己烷除净后自然冷却至60℃，向冷却后的体系中逐滴加入含有2.5mmol NaOH和4mmol NH4F的甲醇溶液10mL，搅拌30分钟。搅拌后体系加热至150℃，通氮气1h以除去甲醇。

氮气保护下，反应体系加热至300℃，反应1h，待反应完成后，自然冷却至室温。

向反应产物中加入10mL乙醇，15000rpm离心10min，弃去上清溶液；将所得固体分散在10mL环己烷中，加入20mL乙醇，离心分离，最终将所得β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核分散在10mL环己烷中。

对β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核进行透射电镜表征，结果如图2所示，材料为均一的球形，尺寸约为47nm。

对β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核进行光谱表征，结果如图3所示，在980nm激发下，材料在540nm、660nm均有发射峰，表现为特征的上转换发光性质。并且β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核荧光强度约为实施例1β-NaYF4:Yb,Er内核荧光强度的4.2倍。

实施例3：α-NaYF4:Yb,Nd内核的合成及发光性质研究

取2.84g(10mmol)油酸，2.67g(10mmol)油胺，5.04g(20mmol)十八烯，1mmol稀土三氟乙酸盐(Y:Yb:Nd＝33:7:60)，1mmol三氟乙酸钠于100ml三颈瓶中，封装体系，抽气并升温至110℃，直至形成透明澄清溶液。

抽换气三次，通氮气，升温至300℃反应30min；反应结束后自然冷却，用3mL环己烷荡洗三颈瓶，加入10mL的无水乙醇，15000rpm离心10min，沉淀用约20ml乙醇/环己烷混合液(乙醇/环己烷体积比3/1)洗三次，所得α-NaYF4:Yb,Nd内核存于10ml环己烷中。

对α-NaYF4:Yb,Nd内核进行透射电镜表征，结果如图4所示，α-NaYF4:Yb,Nd内核为均一的球形，尺寸约11nm。

对α-NaYF4:Yb,Nd内核进行光谱表征，结果如图6所示，在808nm激发下，材料在980nm有发射峰，表现为特征的近红外发光性质。

实施例4：α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核的合成及发光性质研究

取20mmol油酸(5.68g)和20mmol十八烯(5.04g)，100mg实施例3所得α-NaYF4：Yb,Nd内核(分散在10mL环己烷中)混合，并加入2mmol三氟乙酸钙，在氮气保护下加热至80℃以上蒸去环己烷，封装体系，抽气并升温至110℃，直至形成透明澄清溶液。

抽换气三次，通氮气，升温至300℃反应30min；待反应完成后，自然冷却至室温，加入10mL乙醇，15000rpm离心10min，弃去上清溶液；将所得固体分散在10mL环己烷中，加入20mL乙醇，离心分离，最终将所得α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核分散在10mL环己烷中。

对α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核进行透射电镜表征，结果如图5所示，材料为均一的立方体，尺寸约为16nm。

对α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核进行光谱表征，结果如图6所示，在808nm激发下，α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核在980nm有发射峰，表现为特征的近红外发光性质。并且α-NaYF4:Yb,Nd@CaF2内核荧光强度是实施例3α-NaYF4:Yb,Nd内核的2-3倍。

实施例5：水热法合成NaYF4:Nd内核及发光性质研究

配制NaCl和LnCl3(95％YCl3和5％NdCl3)的乙二醇溶液，其中NaCl浓度为0.2M，LnCl3浓度为0.1M。

取15mL上述混合溶液，加入7.5mL聚乙烯亚胺的乙二醇溶液(5％wt)，在室温下搅拌0.5h后，加入10mL氟化铵(0.6M)的乙二醇溶液，室温下搅拌1h。

搅拌完毕后混合溶液投入50mL高压反应釜内，放置于200℃烘箱内，反应4小时。待反应釜自然冷却至室温，将反应溶液转移至离心管内，离心分离出沉淀，用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)多次洗涤。终产物NaYF4:Nd内核分散在10mL纯水中。

对NaYF4:Nd内核进行透射电镜表征，结果如图7所示，材料形貌均一，尺寸约为31nm。

对NaYF4:Nd内核进行光谱表征，结果如图8所示，在808nm激发下，材料在890nm、1064nm和1330nm有发射峰，表现为特征的近红外发光性质。

实施例6：利用反相微乳法对内核进行二氧化硅壳层的包覆以及双键硅烷的修饰

取20mg实施例2β-NaYF4:Yb,Er@NaLuF4内核分散到5mL环己烷中，配制成溶液A。

称取1.0g CO-520加入到5mL环己烷中，混合溶解，配制成溶液B。

在超声条件下，将溶液A滴加到溶液B中，得到混合溶液。

向混合溶液加入氨水70μL，置于摇床中振荡3h，摇床转速为200rpm、温度为25℃。

振荡完毕后，向反应体系中加入正硅酸乙酯TEOS 80μL，水解反应24h，摇床转速和温度同上。

水解后加入3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(3-Methacryloxypropyltrimethoxysilane,MPS)20μL，继续反应24h，摇床转速和温度同上。

待反应完成后，加入10mL乙醇破乳，16500rpm离心10min，产物用大量乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗涤三次，最终得到RENPs@SiO2-MPS分散在10mL乙醇中，浓度为3mg/mL。

对RENPs@SiO2-MPS进行透射电镜表征，结果如图9所示。正硅酸乙酯水解后在纳米材料表面形成了致密的二氧化硅壳层，壳层厚度约为10nm。

实施例7：利用Stober法对内核进行二氧化硅壳层的包覆以及双键硅烷的修饰

取40mg实施例5中的NaYF4:Nd内核分散于9mL氨水的乙醇溶液中(4.2％体积浓度)，加入100μL正硅酸乙酯的乙醇溶液(10％体积浓度)，室温下搅拌12h。反应结束后，15000rpm离心10min，弃上清，产物分散于10mL乙醇中。

将分散于10mL乙醇中的产物加入到40mL乙醇和10mL纯水的混合溶液中，再加入400μLMPS，搅拌均匀后加入2mL氨水。混合溶液在70℃下反应24h。反应结束后离心弃上清，产物用大量乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗涤，最终将所得RENPs@SiO2-MPS分散在乙醇中。

对RENPs@SiO2-MPS进行透射电镜表征，结果如图10所示。正硅酸乙酯水解后在纳米材料表面形成了致密的二氧化硅壳层，壳层厚度约为12nm。

实施例8：丙烯酸与苯乙烯共聚合成羧基化聚苯乙烯壳层

利用丙烯酸与苯乙烯制备RENPs@SiO2@PS-COOH的合成路径示意图如图11所示。具体合成方法如下：

将实施例6制备好的RENPs@SiO2-MPS(共计30mg)全部加入到25mL乙醇和25mL水混合溶液中，加入1.0mL苯乙烯单体(Styrene,St)，常温下，在搅拌状态下通氮气30分钟。

反应体系升温至75℃，用注射器向反应体系中注入1mL过硫酸钾(20mg/mL)的水溶液，反应1h。

再向体系中加入0.2mL丙烯酸(Acrylic acid,AA)和0.06mL二乙烯基苯，75℃反应4h后，停止加热，自然冷却至室温。

产物分成两份，16500rpm离心15min，沉淀先用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗两遍，之后再用纯水洗三遍；最终得到的RENPs@SiO2@PS-COOH产物分散在20mL纯水中，浓度为2.4mg/mL，避光室温保存。产物记为RENPs@PS&AA(即AA提供羧基)。

对RENPs@PS&AA进行透射电镜表征，结果见图12。包裹聚苯乙烯壳层后，材料的尺寸(直径)约为120nm，聚苯乙烯壳层厚度(即聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离)约为75nm。

对RENPs@PS&AA进行表面电位表征，结果如图13所示。RENPs@PS&AA在弱碱性溶液(pH7.4)中，电位约为-55.3mV，表现出较强的电负性，是表面羧基电离的结果。

对RENPs@PS&AA进行红外光谱表征，并以聚丙烯酸(PAA)和未修饰羧基的RENPs@PS进行对比，结果如图14所示。RENPs@PS&AA具有特征的羧基吸收峰(1725cm-1)，证明其聚苯乙烯壳层表面修饰上了羧基官能团。

未修饰羧基的RENPs@PS的合成方法如下：

将实施例6制备好的30mg RENPs@SiO2-MPS加入到25mL乙醇和25mL水混合溶液中，加入1.0mL苯乙烯单体(Styrene,St)，常温下，在搅拌状态下通氮气30分钟。

反应体系升温至75℃，用注射器向反应体系中注入1mL过硫酸钾(20mg/mL)的水溶液，反应5h。

产物分成两份，16500rpm离心15min，沉淀先用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗两遍，之后再用纯水洗三遍；最终得到的RENPs@SiO2@PS产物分散在20mL纯水中，避光室温保存。产物即为RENPs@PS。

实施例9：衣康酸与苯乙烯共聚合成羧基化聚苯乙烯壳层

将实施例6中制备好的30mgRENPs@SiO2-MPS加入到25mL乙醇和25mL水的混合溶液中，加入1.0mL苯乙烯单体，在搅拌状态下通氮气30分钟。

反应体系升温至75℃，用注射器向反应体系中注入1mL过硫酸钾(20mg/mL)的水溶液，反应1h。

再向体系中加入0.20g衣康酸(Italic acid,IA)和0.06mL二乙烯基苯，75℃反应4h后，停止加热，自然冷却至室温。

产物分成两份，16500rpm离心15min，沉淀先用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗两遍，之后再用纯水洗三遍。最终得到的RENPs@SiO2@PS-COOH产物分散在20mL纯水中，避光室温保存。产物记为RENPs@PS&IA。

对RENPs@PS&IA进行透射电镜表征，结果见图15。包裹聚苯乙烯壳层后，RENPs@PS&IA的尺寸(直径)约为182nm，聚苯乙烯壳层的厚度(即聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离)约为136nm。

对RENPs@PS&IA进行表面电位表征，结果如图16所示。RENPs@PS&IA在弱碱性溶液(pH7.4)中，电位约为-50.0mV，表现出较强的电负性，是表面羧基电离的结果。

实施例10：甲基丙烯酸与苯乙烯共聚合成羧基化聚苯乙烯壳层

将实施例6中制备好的30mgRENPs@SiO2-MPS加入到25mL乙醇和25mL水的混合溶液中，加入1.0mL苯乙烯单体，在搅拌状态下通氮气30分钟。

反应体系升温至75℃，用注射器向反应体系中注入1mL过硫酸钾(20mg/mL)的水溶液，反应1h。

再向体系中加入0.20g甲基丙烯酸(Methacrylic acid,MA)和0.06mL二乙烯基苯，75℃反应4h后，停止加热，自然冷却至室温。

产物分成两份，16500rpm离心15min，沉淀先用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗两遍，之后再用纯水洗三遍。最终得到的RENPs@SiO2@PS-COOH产物分散在20mL纯水中，避光室温保存。产物记为RENPs@PS&MA。

对RENPs@PS&MA进行透射电镜表征，结果见图17。包裹聚苯乙烯壳层后，RENPs@PS&MA的尺寸(直径)约为153nm，聚苯乙烯壳层厚度(即聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离)约为110nm。

对RENPs@PS&MA进行表面电位表征，结果如图18所示。RENPs@PS&MA在弱碱性溶液(pH7.4)中，电位约为-59.0mV，表现出较强的电负性，是表面羧基电离的结果。

实施例11：马来酸酐与苯乙烯共聚合成羧基化聚苯乙烯壳层

将实施例6中制备好的30mgRENPs@SiO2-MPS加入到25mL乙醇和25mL水的混合溶液中，加入1.0mL苯乙烯单体，在搅拌状态下通氮气30分钟。

反应体系升温至75℃，用注射器向反应体系中注入1mL过硫酸钾(20mg/mL)的水溶液，反应1h。

再向体系中加入0.20g马来酸酐(Maleic anhydride,MAH)和0.06mL二乙烯基苯，75℃反应4h后，停止加热，自然冷却至室温。

产物分成两份，16500rpm离心15min，沉淀先用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)洗两遍，之后再用纯水洗三遍。最终得到的RENPs@SiO2@PS-COOH产物分散在20mL纯水中，避光室温保存。产物记为RENPs@PS&MAH。

对RENPs@PS&MAH进行透射电镜表征，结果见图19。包裹聚苯乙烯壳层后，RENPs@PS&MAH的尺寸(直径)约为124nm，聚苯乙烯壳层厚度(即聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离)约为107nm。

对RENPs@PS&MAH进行表面电位表征，结果如图20所示。RENPs@PS&MAH在弱碱性溶液(pH7.4)中，电位约为-62.4mV，表现出较强的电负性，是表面羧基电离的结果。

实施例12：反应时间和丙烯酸投入量与聚苯乙烯层的羧基浓度的关系

以实施例8方法为基础，考查反应时间和丙烯酸投入量对表面羧基浓度的影响。

在加入含有羧基的单体丙烯酸后聚合反应时间分别调整为3h、6h、9h和12h，其余步骤同实施例8，对各组获得的RENPs@PS&AA进行表面羧基浓度的测定，测定方法如下：

在氮气氛围下，向RENPs@PS&AA的水溶液中滴加已知浓度的氢氧化钠溶液，搅拌1分钟后进行电导率的测定，一直滴加氢氧化钠直至溶液pH到11。根据电导率变化的曲线确定RENPs@PS&AA表面羧基消耗的氢氧化钠的量，并确定羧基浓度。

最终得出，对于反应3h、6h、9h和12h得到的RENPs@PS&AA，其每毫克RENPs@PS&AA的表面羧基含量分别是7.95nmol、12.75nmol、18.95nmol、20.62nmol。当反应时间达到9h，继续延长反应时间，羧基浓度不会有更大的提高，确定9h为最佳反应时间。

另外，对丙烯酸添加量进行调整，分别加入苯乙烯质量的10％、20％、30％、40％的含有羧基的单体丙烯酸，其余步骤同实施例8，最后对产物进行羧基浓度的测定，方法同上。

最终得出，对于投入10％、20％、30％、40％丙烯酸得到的RENPs@PS&AA，其每毫克RENPs@PS&AA表面羧基浓度分别是6.15nmol、8.20nmol、9.52nmol、8.85nmol。随着丙烯酸投入量的增大，羧基浓度先增大后减少，最佳丙烯酸投入量为苯乙烯质量的30％(质量比)。

实施例13：利用乙二胺将羧基转换为氨基官能团

取实施例8中获得的40mg RENPs@PS&AA，分散在10mLDMF中，加入100mg的EDC和100mg的Sulfo-NHS，室温下搅拌1小时，15000rpm离心10min除去上清液。

离心所得沉淀分散在10mLDMF中，加入3μg乙二胺，继续在室温下搅拌12小时。反应结束后离心分离，沉淀用水和乙醇洗涤两次后分散在纯水中，最终得到氨基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-NH2。

实施例14：利用戊二醛将羧基转换为醛基官能团

按实施例13中的方法，将RENPs@PS&AA转化为氨基功能化材料RENPs@SiO2@PS-NH2。

取40mg上述RENPs@SiO2@PS-NH2，分散在10mLPB缓冲溶液中(pH＝7.2，0.03M)，加入300μL2％戊二醛溶液，室温下搅拌3小时，15000rpm离心10min除去上清液。

离心所得沉淀分散在PB缓冲溶液中，并用PB缓冲溶液洗涤三次，最终得到醛基功能化材料，记为RENPs@SiO2@PS-CHO。

实施例15：在聚苯乙烯壳层中包埋有机小分子，构建多功能材料

取40mg实施例8中获得的RENPs@PS&AA分散10mL纯水中，加入100μL染料Rh760的四氢呋喃溶液(1mmol/L)，混合溶液在40℃条件下溶胀60分钟。

溶胀结束后，离心除去上清液中多余的染料，收集沉淀并用乙醇和水的混合溶液(乙醇：水＝1:1，体积比)多次洗涤，最终分散在纯水中。

获得的材料即为聚苯乙烯壳层负载Rh760的RENPs@PS&AA，该材料同时具有稀土内核的发光性质和有机染料的发光性质。染料Rh760负载前后的荧光发射光谱如图21所示，Rh760被包埋后的最大发射峰位置出现了轻微的红移，是包埋在聚苯乙烯中后发生的聚集现象导致的。负载染料后的RENPs@PS&AA的溶液照片如插图所示，由于染料本身为蓝色，因此包埋染料后的材料溶液呈淡蓝色。

实施例16：羧基功能化RENPs@SiO2@PS-COOH偶联抗体及其免疫层析应用

以实施例8制备的RENPs@PS&AA为例，进行生物偶联并将其应用于免疫层析检测技术。

(1)生物偶联

取1mg RENPs@PS&AA，加入0.5mLBBS(硼酸盐缓冲液，0.2M,pH＝7.4)13400rpm离心10min，沉淀分散于0.9mLBBS溶液中。

向分散体系中加入Sulfo-NHS 95.5μg，EDC 168μg，活化反应60min后，11000rpm离心10min。

沉淀加1mLBBS缓冲液，超声功率45W分散1min后，加入49.2μg甲胎蛋白(AFP)的一抗，室温下反应3h，之后加入100μLBSA(5％)封闭1h。离心，取沉淀分散于1mL含1％蔗糖和0.1％Proclin300的水溶液中，4℃保存。

(2)硝基纤维素膜的处理和蛋白的固定

将硝基纤维素膜粘贴在PVC底板的中央位置。将甲胎蛋白抗体稀释到1.8mg/mL，兔抗甲胎蛋白抗体稀释到2.1mg/mL，用划膜仪分别划于硝基纤维素膜上获得T线和C线，37℃烘箱处理12小时。

(3)试纸条的组装

取出固定好抗体的硝基纤维素膜，在PVC底板的两端粘贴样品垫和吸水垫，样品垫和吸水垫分别与硝基纤维素膜重叠1mm，得到试纸板。

用自动切膜机将组装好的试纸板切割成3.9mm宽的小条，将小条装载于塑料外壳内，得到免疫层析试纸条。

(4)样品的测试和结果的判读

配制一系列浓度梯度的AFP抗原标准溶液，如1ng/mL，2ng/mL，3ng/mL，6ng/mL，9ng/mL，27ng/mL，135ng/mL，270ng/mL，540ng/mL，677ng/mL，842ng/mL，1082ng/mL。取10μL待测AFP加入到100μL样品稀释液中，样品稀释液为含有1％NaCl、1％BSA和0.5％Tween-20的PB缓冲溶液(pH＝7.4，0.1M)。向稀释的抗原溶液中加入4μg RENPs@PS&AA标记的抗体溶液，待溶液充分混匀后，取100μL加入到试纸条的样品垫上，反应10min后进行读数。

采用980nm激光激光照射层析膜区域，用相机对试纸条进行成像拍摄并读取T线和C线的荧光强度，试纸条的拍摄结果如图22所示。分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线(如图23所示)。该方法的最低可检测抗原浓度为3ng/mL。

实施例17：氨基功能化RENPs@PS偶联抗体及其免疫层析应用

以实施例13制备的RENPs@SiO2@PS-NH2为例，进行生物偶联并将其应用于免疫层析检测技术。

(1)生物偶联

取1mg RENPs@SiO2@PS-NH2加0.5mLBBS(0.2M,pH＝7.4)13400rpm离心10min，沉淀分散于0.9mLBBS溶液中。

向分散体系中加入Sulfo-NHS 560μg，EDC 560μg，3mg甲胎蛋白的一抗，室温下反应4h。之后离心分离，除去上清液，沉淀分散在1mLBBS缓冲液中，加入100μLBSA(5％)封闭1h。离心，取沉淀分散于1mL含1％蔗糖和0.1％Proclin300的水溶液中，4℃保存。

(2)硝基纤维素膜的处理和蛋白的固定

将硝基纤维素膜粘贴在PVC底板的中央位置。将甲胎蛋白抗体稀释到1.8mg/mL，兔抗甲胎蛋白抗体稀释到2.1mg/mL，用划膜仪分别划于硝基纤维素膜上获得T线和C线，37℃烘箱处理12小时。

(3)试纸条的组装

取出固定好抗体的硝基纤维素膜，在PVC底板的两端粘贴样品垫和吸水垫，样品垫和吸水垫分别与硝基纤维素膜重叠1mm，得到试纸板。

用自动切膜机将组装好的试纸板切割成3.9mm宽的小条，将小条装载于塑料外壳内，得到免疫层析试纸条。

(4)样品的测试和结果的判读

配制一系列浓度梯度的AFP抗原标准溶液，如1ng/mL，2ng/mL，3ng/mL，6ng/mL，9ng/mL，27ng/mL，135ng/mL，270ng/mL，540ng/mL，677ng/mL，842ng/mL，1082ng/mL。取10μL待测AFP加入到100μL样品稀释液中，样品稀释液为含有1％NaCl、1％BSA和0.5％Tween-20的PB缓冲溶液(pH＝7.4，0.1M)。向稀释的抗原溶液中加入4μg RENPs@SiO2@PS-NH2标记的抗体溶液，待溶液充分混匀后，取100μL加入到试纸条的样品垫上，反应10min后进行读数。

采用980nm激光激光照射层析膜区域，用相机对试纸条进行成像拍摄并读取T线和C线的荧光强度，试纸条的拍摄结果如图24所示。分别将T/C的荧光强度及对应的抗原浓度做标准曲线(如图25所示)。该方法的最低可检测抗原浓度为3ng/mL。

实施例18：羧基功能化RENPs@SiO2@PS-COOH材料的稳定性研究

以实施例8制备的RENPs@PS&AA为例，研究含功能化聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料的稳定性。

(1)材料的分散性

跟踪RENPs@PS&AA材料合成后的尺寸、分散性的变化，表征方法为利用动态光散射方法测试RENPs@PS&AA在水溶液中的水合粒径。实验结果如图26所示。材料在室温下放置30天后，水合粒径无明显变化。图27中的PDI为材料尺寸的多分布系数，数值越低表示材料的尺寸均一性越好。连续20天的测试结果显示，PDI在0.1附近且数值无明显变化，证明材料始终具有良好的分散性。

(2)材料的表面性质

跟踪RENPs@PS&AA材料合成后的表面性质的变化，表征方法为测定RENPs@PS&AA在pH＝7.4的缓冲溶液中的表面电位。实验结果如图28所示，材料的表面电位在-58mV附近，是由于表面羧基在弱碱性溶液中发生了电离，因此表面表现出电负性。同时，电位的绝对值大于30mV，表明材料具有非常好的稳定性和分散性。连续20天的跟踪测试结果显示，表面电位值无明显变化，证明材料的表面性质比较稳定。

(3)生物偶联后的材料的长期稳定性

参照实施例16中的生物偶联和免疫层析方法对RENPs@PS&AA的长期稳定性做出评价，具体操作：在RENPs@PS&AA表面修饰甲胎蛋白抗体，随后将材料在37℃恒温箱中分别放置0、2、4、6、8天后，再将材料用于免疫层析检测。结果如图29所示，当用于检测浓度为270ng/mL的抗原时，在37℃放置数天后的材料仍然能用于层析检测，且与原始材料有同样的检测效果，层析膜上无滞留现象。此外，图30给出了放置数天后的材料用于免疫层析检测的标准样品检测曲线，各个浓度下的CV值偏差小于15％，表明放置数天后材料仍然能有重复出原始材料的检测结果。以上实验结果都证明，RENPs@PS&AA在进行了抗体偶联后具有非常好的稳定性。

实施例19：羧基功能化RENPs@SiO2@PS-COOH材料与非共价修饰材料RENPs@PAA的对比

以实施例8制备的RENPs@PS&AA和RENPs@PAA为例，对含有聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料与非共价修饰材料进行比较。

PAA指聚丙烯酸，其拥有丰富的羧基官能团，能通过羧基与稀土离子的电荷相互作用吸附在稀土纳米材料的表面，是一种非共价修饰的方法，游离的羧基可用于进行生物偶联。RENPs@PAA的合成方式是：取20mg实施例2制备的β-NaYF4:Yb,Nd@NaLuF4内核，加入5mL的亚硝酰四氟硼酸盐(2mol/L)的二氯甲烷溶液，混匀后进行离心分离。离心的沉淀分散在5mLDMF中，加入150mg聚丙烯酸溶液，升温至80℃，维持3小时。反应结束后进行离心分离，沉淀分散在5mL纯水中备用，材料记为RENPs@PAA。

首先对比两种材料在水溶液中的分散性，表征方法为利用动态光散射测试其水合粒径的分布。结果如图31所示，RENPs@PAA的粒径分布较宽，且在大粒径范围上有分布，表明材料出现了轻微的团聚现象。相比之下，RENPs@PS&AA则表现出单分散的特点，具有更好的分散性和均一性。

此外，对比两种材料的长期稳定性，具体方法是将两种材料偶联抗体后分别在室温下保存。放置30天后，用两种材料分别进行免疫层析实验，对比检测效果。结果如图32所示，RENPs@PS&AA偶联抗体后的材料在放置30天后，仍然具有最初的检测效果，而RENPs@PAA偶联抗体后的材料则出现了团聚的现象，即在试纸条上观察到明显了材料滞留和信号衰减。结果证明，RENPs@PS&AA与非共价修饰材料相比，具有更好的长期稳定性。

实施例20：不同厚度的聚苯乙烯壳层对RENPs@SiO2@PS-COOH的材料密度的影响

为了证明厚度在50-100nm的聚苯乙烯壳层可以为材料提供更强的悬浮力、保证材料在溶液中良好的稳定性，我们进行了以下对比：

选取对照组的材料为聚苯乙烯壳层厚度约10nm的材料，颗粒直径约80nm，实验组是实施例8中获得的RENPs@PS&AA，聚苯乙烯壳层厚度(聚苯乙烯壳层表面到内核表面的最大距离)为75nm，颗粒直径约为120nm。将20mL上述两种材料的水溶液烘干至恒重，测得其质量浓度分别是2.2mg/mL和2.4mg/mL。假设20mg内核RENPs材料含有的颗粒数目是N。因此可近似认为，以20mg RENPs为内核获得的RENPs@SiO2@PS-COOH的颗粒数目也是N。根据质量、体积可算出理论上两种材料的平均密度分别是1.64×1014/N(g/mL)和5.3×1013/N(g/mL)。可见，壳层厚度为10nm的材料密度是壳层厚度为75nm的材料密度的3倍。因此，当分散在纯水溶液中，壳层厚度越厚，其颗粒悬浮力会由于聚苯乙烯的作用增强，使颗粒更易稳定分散在纯水中。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

一种含聚苯乙烯壳层的稀土纳米材料及其生物偶联与应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。