专利摘要
本文公开了基于胰岛素多肽序列的具有独特的胰岛素受体激动剂活性的胰岛素类似物二聚体、连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的二聚化位点和长度。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽独立地为两链胰岛素类似物或单链类似物,且第一和第二胰岛素多肽通过B29-B29’、B1-C8、B1-B1或C8-C8键彼此连接。
权利要求
1. 一种胰岛素类似物二聚体，所述二聚体包含
i) 第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为各包含第一组和第二组A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中对于每组的A链、B链和连接部分，所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过携带PEG或二硫键的二聚化接头彼此连接，所述二聚化接头共价连接相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链，
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；
所述第一和第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)、
GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 89)、
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)、
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)和
AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 92)；
所述第一和所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)和PEG8-X68-PEG4，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58之一为精氨酸，另一个为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；
ii) 第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素多肽为包含第一A链和第一B链的两链胰岛素类似物，其中所述第一A链和第一B链通过链间二硫键彼此连接；
所述第二胰岛素多肽为包含第二A链、第二B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与第二B链的羧基端共价结合，所述连接部分的第二末端与第二A链的氨基端共价结合，
其中第一和第二胰岛素多肽通过携带二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与所述第一胰岛素多肽B链的N端氨基酸的侧链共价连接，且二聚化接头的第二末端与第二胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：CFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 94)、
CGPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 95)、
CGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 96)、
CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYNKPT (SEQ ID NO: 97)、
CAYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 91)和
CAYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 93)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)、
GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、
GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 89)、
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)、
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)和
AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 92)
所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)和PEG8-X68-PEG4，其中
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58之一为精氨酸，另一个为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；
iii) 第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为分别包含第一组和第二组A链和B链的两链胰岛素类似物，其中每组的A链和B链通过链间二硫键彼此连接，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过连接各自的两个B链的羧基端氨基酸的侧链的二聚化接头彼此连接，其中
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；
所述第一和第二胰岛素的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPX68T (SEQ ID NO: 2)和GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNX68PT(SEQ ID NO: 99)，其中
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；或
iv. 第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为各包含第一组和第二组A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中对于每组的A链、B链和连接部分，所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合，而且其中第一和第二胰岛素多肽通过携带PEG或二硫键的二聚化接头彼此连接，其中二聚化接头的第一末端与第一或第二胰岛素多肽之一的连接部分的赖氨酸侧链共价连接，且二聚化接头的第二末端与另一个第一或第二胰岛素多肽的B链的N端胺共价连接，
所述第一胰岛素多肽的所述A链包含序列
TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 103)；
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含序列
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)或
AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 92)；
所述第二胰岛素多肽的所述A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)，和
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)，
所述第一和所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 87)和PEG8-X68-PEG4，
其中
X68为精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
2. 权利要求1的胰岛素类似物二聚体，其中所述二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为单链胰岛素类似物，
所述第一和第二胰岛素的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)和
GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)，
所述第一和第二胰岛素的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)和
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)，
所述二聚化接头包含独立选自以下的序列：GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)和PEG8-X68-PEG4，其中
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
3. 权利要求1的胰岛素类似物二聚体，其中所述二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素多肽为包含第一A链和第一B链的两链胰岛素类似物，其中所述第一A链和第一B链通过链间二硫键彼此连接；
所述第二胰岛素多肽为包含第二A链、第二B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与第二B链的羧基端共价结合，所述连接部分的第二末端与第二A链的氨基端共价结合，
其中第一和第二胰岛素多肽通过第一胰岛素多肽的B链的N端半胱氨酸侧链和第二胰岛素多肽的连接部分的修饰赖氨酸侧链间的二硫键彼此连接，
所述第一和第二胰岛素多肽的所述A链包含独立选自以下的序列：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)；
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：CFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 94)和
CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYNKPT (SEQ ID NO: 97)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含独立选自以下的序列：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)和
GPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 14)；
所述第二胰岛素多肽的所述连接部分包含序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，其中X68为包含以下结构的侧链的氨基酸：
。
4. 权利要求1的胰岛素类似物二聚体，其中所述二聚体包含
第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素和第二胰岛素多肽两者为单链胰岛素类似物，
所述第一胰岛素多肽的所述A链包含序列
TPAKSEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 103)；
所述第一胰岛素多肽的所述B链包含序列
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFY (SEQ ID NO: 90)；
所述第一胰岛素多肽的连接部分包含序列RVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)；
所述第二胰岛素多肽的所述A链包含序列GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)；
所述第二胰岛素多肽的所述B链包含序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)；
所述第二胰岛素多肽的连接部分包含序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，
其中
X68为精氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
。
5. 一种降低与治疗糖尿病有关的低血糖的风险的方法，所述方法包括给予有效量的包含权利要求1-4中任一项的胰岛素类似物二聚体的药物组合物。
6. 一种降低与治疗糖尿病有关的低血糖的风险的方法，所述方法包括给予有效量的包含部分激动剂胰岛素二聚体的药物组合物，
其中所述部分激动剂胰岛素二聚体包含通过二聚化接头彼此连接的第一和第二胰岛素多肽；所述第一和第二胰岛素多肽各自独立包含选自以下的胰岛素多肽
i) 包含通过链间二硫键连接的A链和B链的两链异源双链体；和
ii) 包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素多肽，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合；其中
所述A链包含GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的序列；
所述B链包含X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的序列；其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酸或谷氨酰胺；
X8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为丝氨酸或异亮氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；
X30为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸；
X33为天冬氨酸或谷氨酸；
X34为丙氨酸或苏氨酸；
X41为天冬氨酸或谷氨酸；
X42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；和
R13为COOH或CONH2；和
a) 第一和第二胰岛素多肽通过相应的第一和第二胰岛素多肽B29位处的氨基酸的侧链彼此连接；
b) 所述第一和第二胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过所述第一和第二胰岛素多肽之一的B1位处的氨基酸的侧链和所述连接部分的氨基酸的侧链彼此连接；或
c) 第一和第二胰岛素多肽两者是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。
7. 权利要求6的方法，其中所述单链胰岛素类似物的连接部分选自
GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、
SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)、
X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)、
(SSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX60)n (SEQ ID NO: 18)、MGSSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX60 (SEQ ID NO: 19)；和
W2-Z2-Y2，其中
W2为PEG6、PEG7或PEG8；
Y2为PEG4、PEG5或PEG6；和
Z2为赖氨酸、半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
，其中
n为选自1、2或3的整数；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；
X59和X60独立地为精氨酸或赖氨酸；和
X68为精氨酸、半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数。
8. 权利要求6或7的方法，其中所述第一和第二胰岛素多肽的连接部分独立选自SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)、GYGSSSRKAPQT (SEQ ID NO: 21)、GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)和PEG8-X68-PEG4，其中
X68为包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
m为4。
9. 权利要求6-8中任一项的方法，其中所述第一胰岛素多肽是包含第一连接部分的单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过第二胰岛素多肽的N端胺或B1位的氨基酸的侧链和所述第一连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。
10. 权利要求6-8中任一项的方法，其中所述第二胰岛素多肽是包含通过链间二硫键连接的A链和B链的两链异源双链体；且所述第一胰岛素多肽是包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素多肽，其中连接部分为PEG8-X68-PEG4或GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)，其中
X68为包含以下结构II的侧链的氨基酸：
；和
所述第一和第二胰岛素多肽通过第二胰岛素多肽的N端胺或B1位的氨基酸的侧链和包含存在于第一胰岛素多肽的连接部分的结构II的侧链的氨基酸彼此连接。
11. 权利要求6-10中任一项的方法，其中
所述第一和第二胰岛素多肽包含独立选自以下的A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 11)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)和独立选自以下的B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、
CGPEHLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNPK (SEQ ID NO: 78)、
GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT(SEQ ID NO: 79)和
AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 80)。
12. 权利要求6的方法，其中
所述第一和第二胰岛素多肽各自为单链胰岛素多肽，其中
第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)的B链序列；和
包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分；和
第二胰岛素多肽包含
GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)、TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列和
包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为精氨酸，或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X75为赖氨酸或精氨酸；而且其中
第一和第二胰岛素多肽通过所述第一或第二胰岛素多肽之一的N端胺或B1位的氨基酸的侧链和另一个胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链彼此连接。
13. 一种胰岛素类似物二聚体，所述二聚体包含第一胰岛素多肽和第二胰岛素多肽，其中
所述第一胰岛素多肽是包含以下的单链胰岛素，
GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的第一A链序列；
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的第一B链序列；和
第一连接部分，其中所述第一连接肽的第一末端与第一B链的羧基端共价结合，且所述第一连接部分的第二末端与第一A链的氨基端共价结合；
所述第二胰岛素多肽是包含以下的单链胰岛素或两链胰岛素
GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的第二A链序列；和
X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的第二B链序列，
前提条件是当所述第二胰岛素多肽为单链胰岛素时，所述第二胰岛素多肽还包含第二连接部分，其中所述第二连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述第二连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合；
所述第一和第二胰岛素多肽通过键或双官能连接部分而彼此连接，所述键或双官能连接部分共价连接所述第一连接部分8位的氨基酸的侧链与
a) 第二胰岛素多肽的氨基端；或
b) 第二连接部分8位的氨基酸的侧链，其中
X4为谷氨酸或天冬氨酸；
X5为谷氨酸或谷氨酰胺；
X8为苏氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；
X9为丝氨酸、精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X10为丝氨酸或异亮氨酸；
X12为丝氨酸或天冬氨酸；
X14为精氨酸、酪氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X15为谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、鸟氨酸或亮氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺或苏氨酸；
X19为酪氨酸、4-甲氧基-苯丙氨酸或4-氨基苯丙氨酸；
X21为丙氨酸、甘氨酸或天冬酰胺；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X29为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；
X30为组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、高半胱磺酸或半胱磺酸；
X33为天冬氨酸或谷氨酸；
X34为丙氨酸或苏氨酸；
X41为天冬氨酸或谷氨酸；
X42为丙氨酸、鸟氨酸或精氨酸；
X45为酪氨酸或苯丙氨酸；和
R13为COOH或CONH2，而且其中相对于天然胰岛素，所述二聚体显示60%或更小的最大剂量反应。
14. 权利要求13的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一连接部分和任选第二连接部分独立选自
GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)、X51X52GSSSX57X58APQT (SEQ ID NO: 16)、(SSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQX60)n (SEQ ID NO: 18)、MGSSSSX59APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQEEEEEX60 (SEQ ID NO: 19)，和
W2-Z2-Y2，其中
W2为PEG6、PEG7或PEG8；
Y2为PEG4、PEG5或PEG6；和
Z2为赖氨酸、半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
，其中
n为选自1、2或3的整数；
X51选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸；
X52为丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸；
X57和X58独立地为精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、乙酰基-苯丙氨酸或鸟氨酸；
X59和X60独立地为精氨酸或赖氨酸；和
X68为半胱氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数。
15. 权利要求13的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一连接部分和任选第二连接部分独立由序列GYGSSSRKAPQT (SEQ ID NO: 21)、GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)、SRVSRX68SR (SEQ ID NO: 98)或PEG8-X68-PEG4组成，其中m为4。
16. 权利要求13-15中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中所述第二胰岛素多肽为两链胰岛素，且所述第一和第二胰岛素多肽通过键或双官能连接部分彼此共价结合，所述键或双官能连接部分共价连接第一连接肽8位的氨基酸的氨基酸侧链与第二胰岛素多肽的B链的N端α胺。
17. 权利要求15的胰岛素类似物二聚体，其中所述第二胰岛素多肽是单链胰岛素，且所述第一和第二胰岛素多肽通过键或双官能连接部分彼此共价结合，所述键或双官能连接部分共价连接所述第一连接肽8位的氨基酸的氨基酸侧链与第二连接肽8位的氨基酸侧链。
18. 权利要求15的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一连接部分由PEG8-X68-PEG4或序列GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)组成，其中X68为具有以下结构I的侧链的氨基酸：
其中m为选自1-4的整数，且第一和第二胰岛素多肽通过具有以下结构I的侧链的第一连接部分氨基酸的侧链：
与添加至第二胰岛素多肽N端的半胱氨酸的侧链间的二硫键彼此共价结合。
19. 权利要求13-18中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一和第二胰岛素多肽具有相同的序列。
20. 权利要求13-18中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一胰岛素多肽包含天然的人胰岛素A链和B链，且所述第二胰岛素多肽包含IGF-2 A链和B链。
21. 权利要求20的胰岛素类似物二聚体，其中
所述第一和第二胰岛素多肽各自为单链胰岛素多肽，其中
第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 23)的B链序列；和
包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分；和
第二多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA SEQ ID NO: 87)的B链序列；和
包含选自PEG8-X68-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为精氨酸，或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；和
X75为赖氨酸或精氨酸；而且其中
第一和第二胰岛素多肽通过所述第一或第二胰岛素多肽之一的B链的N端胺或B1位的氨基酸的侧链和另一个胰岛素多肽的连接部分的赖氨酸侧链彼此连接。
22. 权利要求13-20中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中
所述第一和第二胰岛素多肽包含GIVDECCX8X9SCDLRRLEX18YCX21-R13 (SEQ ID NO: 81)的A链序列；和X25LCGAELVDALYLVCGDX42GFY (SEQ ID NO: 82)的B链序列，其中
X8为组氨酸或苯丙氨酸；
X9为精氨酸、鸟氨酸或丙氨酸；
X18为甲硫氨酸、天冬酰胺；
X21为丙氨酸或天冬酰胺；
X25为组氨酸或苏氨酸；
X42选自丙氨酸、鸟氨酸和精氨酸；且R13为COOH。
23. 权利要求22的胰岛素类似物二聚体，其中
所述第一和第二胰岛素多肽包含独立选自以下的A链：GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)、GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)和GIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 7)和独立选自以下的B链：FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2)、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFYFNKPT(SEQ ID NO: )和AYRPSETLCGGELVDTLYLVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 80)。
24. 权利要求22的胰岛素类似物二聚体，其中
X8为苯丙氨酸；
X9为精氨酸；
X18和X21两者为天冬酰胺；
X25为组氨酸；和
X42为精氨酸。
25. 权利要求13-20中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中
所述第一和第二胰岛素多肽的A链包含独立选自GIVDECCX8RSCDLRRLENYCN (SEQ ID NO: 83)和GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的序列；和
所述第一和第二胰岛素多肽的B链包含独立选自GPETLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 77)、HLCGAELVDALYLVCGDRGFY (SEQ ID NO: 84)和HLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 85)的序列，其中X8为组氨酸或苯丙氨酸。
26. 权利要求1-4和13-25中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中亲水部分与连接部分的氨基酸或选自A链的A9、A14和A15或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位的氨基酸共价连接。
27. 权利要求26的胰岛素类似物二聚体，其中所述亲水部分是聚乙二醇链。
28. 权利要求1-4和13-27中任一项的胰岛素类似物二聚体，其还包含下式X结构的二肽元件，所述二肽元件通过所述二肽元件和第一或第二胰岛素多肽的胺之间形成的酰胺键与所述胰岛素类似物二聚体连接：
X
其中
R1、R2、R4和R8独立选自H、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)SH、(C2-C3烷基)SCH3、(C1-C4烷基)CONH2、(C1-C4烷基)COOH、(C1-C4烷基)NH2、(C1-C4烷基)NHC(NH2+)NH2、(C0-C4烷基)(C3-C6环烷基)、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7、(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)和C1-C12烷基(W1)C1-C12烷基，其中W1为选自N、S和O的杂原子，或
R1和R2与它们所连接的原子一起形成C3-C12环烷基或芳基；或
R4和R8与它们所连接的原子一起形成C3-C6环烷基；
R3选自C1-C18烷基、(C1-C18烷基)OH、(C1-C18烷基)NH2、(C1-C18烷基)SH、(C0-C4烷基)(C3-C6)环烷基、(C0-C4烷基)(C2-C5杂环基)、(C0-C4烷基)(C6-C10芳基)R7和(C1-C4烷基)(C3-C9杂芳基)，或R4和R3与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；
R5为NHR6或OH；
R6为H、C1-C8烷基，或R6和R1与它们所连接的原子一起形成4、5或6元杂环；和
R7选自H、OH、C1-C18烷基、C2-C18烯基、(C0-C4烷基)CONH2、(C0-C4烷基)COOH、(C0-C4烷基)NH2、(C0-C4烷基)OH和卤素。
29. 权利要求28的胰岛素类似物二聚体，其中
R1和R2独立地为C1-C18烷基或芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-12元杂环；
R4和R8独立选自氢、C1-C18烷基和芳基；和
R5为胺或羟基。
30. 权利要求28的胰岛素类似物二聚体，其中
R1和R2独立选自氢、C1-C8烷基和芳基；
R3为C1-C18烷基，或R3和R4与它们所连接的原子一起形成4-6元杂环；
R4和R8各自为氢；和
R5选自胺、N-取代的胺和羟基。
31. 权利要求28的胰岛素类似物二聚体，其还包含与二肽元件的氨基酸连接的贮库聚合物。
32. 权利要求1-4和8-26中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中所述第一或第二胰岛素多肽的氨基酸侧链通过烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或硫酯键与酰基或烷基共价连接，其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的。
33. 权利要求28-30中任一项的胰岛素类似物二聚体，其中包含二肽元件的氨基酸之一的氨基酸侧链通过烷基胺、酰胺、醚、酯、硫醚或硫酯键与酰基或烷基共价连接，其中所述酰基或烷基对于天然存在的氨基酸是非天然的。
34. 权利要求32的胰岛素类似物二聚体，其中所述二聚体在选自以下一个或多个位置处被酰化：B链的N端α胺；A14、A15、B1、B2、B10、B22、B28、B29位的氨基酸的侧链；氨基酸的侧链或连接部分的氨基酸侧链。
35. 一种药物组合物，其包含权利要求1-4或13-34中任一项的胰岛素类似物二聚体和药学上可接受的载体。
36. 一种治疗糖尿病的方法，所述方法包括给予有效量的权利要求35的药物组合物。
37. 权利要求1-4或13-34中任一项的化合物在制备用于治疗高血糖症的药物中的用途。
38. 权利要求1-4或13-34中任一项的化合物治疗糖尿病的用途。
说明书
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年9月26日提交的美国临时专利申请号61/705,834的优先权，其内容通过引用以其整体结合到本申请中。
电子提交材料通过引用予以结合
通过引用以其整体予以结合的是随之同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并且如下识别：2013年9月25日创建的名为“216463SEQLIST_ST25.txt”的45千字节ACII (文本)文件。
发明背景
胰岛素是一种由两链异二聚体组成的肽激素，其通过酶促加工以生物合成法来源于低效能单链胰岛素原前体。人胰岛素由通过二硫键结合在一起的两条肽链(“A链” (SEQ ID NO: 1)和“B链” (SEQ ID NO: 2))组成，具有共51个氨基酸。B链的C端区和A链的两个末端区在三维结构中缔合以装配用于高亲和力结合胰岛素受体的部位。
胰岛素在几乎所有形式的糖尿病中显示降低葡萄糖的优良无比的能力。遗憾的是，其药理学不是葡萄糖敏感性的，因此能够过度起作用，过度起作用可导致危及生命的低血糖。不稳定的药理学是胰岛素疗法的标志，使得极难以在不发生低血糖的情况下使血糖正常化。而且，天然胰岛素的作用时间短，需要修饰以使其适用于控制基础葡萄糖。延迟胰岛素起效的已确立方法包括降低溶解度和白蛋白结合。
胰岛素样生长因子1和2是其A和B链序列是高度同源的单链线性肽激素，与天然胰岛素具有约50%同源性。IGF A和B链通过“C-肽”连接，其中两种IGF的C肽在大小和氨基酸序列上不同，第一种长度为12个氨基酸，第二种为8个氨基酸。人IGF-1是70个aa的碱性肽，具有SEQ ID NO: 3所示蛋白质序列，与胰岛素原有43%同源性(Rinderknecht等(1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776)。人IGF-2是67个氨基酸碱性肽，具有SEQ ID NO: 4所示蛋白质序列。IGF显示对胰岛素B受体同种型比对A受体同种型显著更低的活性。
申请人之前已鉴定出对胰岛素受体显示高活性的基于IGF-l的胰岛素肽类似物(其中B链的天然Gln-Phe二肽被Tyr-Leu置换) (参见PCT/US2009/068713，其公开内容结合到本文中)。所述类似物(本文称为IGFYL类似物肽)比胰岛素更容易合成，并且能够开发用于胰岛素受体和IGF-1受体的共同激动剂(co-agonist)类似物和选择性胰岛素受体特异性类似物。而且，这些胰岛素类似物还可配制成用于本公开内容的单链胰岛素激动剂(参见PCT/US2001/040699，其公开内容结合到本文中)。
可以形成胰岛素和胰岛素类似物的多聚体，并可按与天然人胰岛素类似的方式用于治疗糖尿病。如本文所公开的，申请人发现胰岛素类似物二聚体的活性高度依赖于连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的大小和位置。如本文所公开的，申请人发现保持完全固有效能但仅部分最大反应性的胰岛素二聚体以及对亚型B胰岛素受体有选择性的二聚体。在从给药部位清除和在血浆中平衡后，这类二聚体可提供更精确受控的胰岛素作用的开始和持续时间。
发明概述
本文公开了具有胰岛素受体激动剂活性的胰岛素类似物二聚体，其中二聚体的胰岛素活性水平随胰岛素多肽序列、二聚化的位点和连接两个胰岛素多肽的二聚化接头的长度而变化。胰岛素二聚体在第一和第二胰岛素多肽之间形成，其中每个胰岛素多肽包含A链和B链。本文公开的二聚体的第一和第二胰岛素多肽可独立选自两链胰岛素类似物或单链胰岛素类似物，其中第一和第二胰岛素多肽通过共价键或双官能接头彼此共价连接。
可采用本领域技术人员已知的标准技术，通过在两个官能团之间形成共价键，使第一和第二胰岛素多肽彼此共价结合。例如两个胰岛素多肽可包含或经修饰以包括允许二聚化键形成的必需官能团，所述二聚化键包括二硫键、酰胺键、硫醚键或酯键。在某些实施方案中，提供双官能接头以连接第一和第二胰岛素多肽，其中双官能接头包含羟基和羧酸基，或胺基和羧酸基或硫醇基和羧酸基或硫醇基和硫醇基。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接，而在一个备选的实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过硫醚键连接。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体是包含第一和第二胰岛素多肽的胰岛素超级激动剂(super agonist) (即对胰岛素受体具有比天然胰岛素大的活性)，其中第一和第二胰岛素多肽各自为两链胰岛素。更具体地讲，第一胰岛素多肽通过每个B链的N端α胺或通过第一和第二胰岛素多肽的B1氨基酸的侧链与第二胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过位于相应的第一和第二胰岛素单链多肽的各个B链N端α胺的二硫键彼此连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链和B链是天然人胰岛素A链和B链。在一个实施方案中，提供治疗糖尿病的改进方法，其中给予患者胰岛素超级激动剂。有利的是，使用超级激动剂允许以降低的浓度(包括33%、30%、25%、20%或小于20%的天然胰岛素的标准剂量浓度的浓度)给予胰岛素二聚体。另外，可使用超级激动剂胰岛素二聚体形成缀合物，其中非胰岛素组分的大小减小一半(相对于使用胰岛素单体的情况)，因为非胰岛素组分可与包含二聚体的第一和第二胰岛素多肽两者连接。例如第一和第二胰岛素多肽可被聚乙二醇化，其中各个PEG链的大小为5-10或5-20 Kd。从商业前景和治疗前景角度看，预期给予低浓度的具有与第一和第二胰岛素多肽连接的低分子量缀合物部分的胰岛素超级激动剂提供有益结果。
在一个实施方案中，胰岛素二聚体显示胰岛素部分激动剂活性。申请人不希望受任一种理论束缚，但是认为本文公开的胰岛素二聚体的部分激动剂活性来源于这样的事实，即该二聚体显示混合的激动剂/拮抗剂活性。在一个实施方案中，提供包含第一和第二胰岛素多肽的胰岛素部分激动剂二聚体，其中第一和第二胰岛素多肽各自为两链胰岛素多肽，且第一胰岛素多肽通过每个B链的羧基端，包括例如通过独立选自B26、B27、B28、B29和B30的氨基酸位置的氨基酸侧链，与第二胰岛素多肽连接。在一个实施方案中，相对于天然胰岛素，胰岛素部分激动剂对胰岛素受体具有小于66%、50%、40%、33%或20%最大活性。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过B链C端氨基酸(例如半胱氨酸)的氨基酸侧链间的二硫键任选通过添加至C端氨基酸(例如B27-B30)侧链的接头彼此连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽通过在第一和第二胰岛素多肽各自的B29氨基酸的氨基酸侧链之间形成的二硫键连接。在一个实施方案中，B29氨基酸是具有以下结构I的侧链的修饰赖氨酸：
，且第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽的A链和B链是天然的人胰岛素A链和B链。
在一个备选的实施方案中，提供显示胰岛素部分激动剂活性的胰岛素二聚体，其中第一和第二胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素，且第一和第二胰岛素多肽通过单链胰岛素多肽的连接部分的氨基酸侧链和第二胰岛素多肽B链的N端α胺或N端氨基酸的侧链彼此连接。任选第一和第二胰岛素多肽通过添加至单链类似物氨基酸侧链、添加至第一和第二胰岛素多肽各自B链的N端α胺，或N端氨基酸(例如B1-B4)的侧链的接头(例如半胱氨酸)连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽各自包含具有以下结构I的侧链的修饰赖氨酸：
，且第一和第二胰岛素多肽通过二硫键连接。在一个实施方案中，第一和第二胰岛素多肽两者是其B链通过连接部分与A链连接的单链胰岛素多肽和通过第一和第二胰岛素多肽各自的连接部分每一个的氨基酸侧链彼此连接形成的胰岛素二聚体。按照一个实施方案，第一和第二胰岛素多肽包含人胰岛素的B链和A链或其类似物或衍生物。在一个实施方案中，单链胰岛素多肽连接部分8位上氨基酸的侧链与第二胰岛素多肽B链的N端氨基酸连接(即B1-C8键)。在一个实施方案中，二聚体包含通过B1-C8键与IGF1或IGF II或其类似物连接的人胰岛素多肽。
在一个实施方案中，本文公开的胰岛素二聚体的一个或两个胰岛素多肽还包含通过酰胺键或酯键与二聚体的第一或第二胰岛素多肽的氨基酸的N端α胺或侧链胺共价连接的自切割的二肽元件(U-B) (参见国际申请WO 2009/099763和PCT/US2009/068713，其公开内容在本文通过引用予以结合)。二肽随后的脱去可发生在生理条件下和在不存在酶活性时。在一个实施方案中，前药元件包含结构U-B的二肽，其中U为氨基酸或羟酸，B为通过B的羧基部分和胰岛素多肽的胺之间的酰胺键与所述单链胰岛素激动剂连接的N-烷基化氨基酸，其中U、B或U-B与之连接的单链胰岛素激动剂的氨基酸是非编码氨基酸。
本公开内容包括胰岛素激动剂二聚体的其它衍生物，包括改进基础胰岛素多肽的溶解度的修饰。在一个实施方案中，通过亲水部分与A链或B链的N端或与第一和第二胰岛素多肽的一个或两个的氨基酸侧链的共价键，包括与单链胰岛素多肽的连接肽的氨基酸侧链的键，提高胰岛素多肽的溶解度。在一个实施方案中，亲水部分与选自以下位置的氨基酸的侧链连接：A链的A9、A14和A15或B链的B1、B2、B10、B22、B28或B29位。在一个实施方案中，亲水部分为聚乙二醇链、酰基或烷基。在一个实施方案中，亲水部分为白蛋白，包括例如白蛋白类，例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA)。在一个实施方案中，亲水部分为聚乙二醇(PEG)链，其分子量范围选自约500-约40,000道尔顿。在一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量的范围选自约500-约5,000道尔顿。在另一个实施方案中，聚乙二醇链的分子量为约10,000-约20,000道尔顿。
酰化或烷基化可延长胰岛素多肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可有利地延迟对胰岛素受体的作用开始时间和/或延长对胰岛素受体的作用持续时间。在亲水部分连接的相同氨基酸位置上，包括例如在连接部分的8位处或在包含自切割二肽元件的氨基酸的侧链上，胰岛素类似物可被酰化或烷基化。
本公开内容还包括包含本文公开的胰岛素二聚体和药学上可接受的载体的药物组合物。按照一个实施方案，提供包含本文公开的任何胰岛素二聚体(优选其纯度水平为至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的药物组合物。所述组合物可含有浓度为以下的本文公开的胰岛素二聚体：至少0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml、4 mg/ml、5 mg/ml、6 mg/ml、7 mg/ml、8 mg/ml、9 mg/ml、10 mg/ml、11 mg/ml、12 mg/ml、13 mg/ml、14 mg/ml、15 mg/ml、16 mg/ml、17 mg/ml、18 mg/ml、19 mg/ml、20 mg/ml、21 mg/ml、22 mg/ml、23 mg/ml、24 mg/ml、25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含被灭菌并任选储存在各种包装容器中的水溶液。在其它实施方案中，药物组合物包括冻干粉。药物组合物还可作为药盒的一部分包装，所述药盒包括用于将组合物给予患者的一次性装置。可给容器或药盒贴标签以保存在室温下或在冷藏温度下。
按照一个实施方案，提供调节胰岛素依赖性患者的血糖水平的改进方法，更具体地讲，提供伴随低血糖的风险降低而治疗糖尿病的方法。所述方法包括以对控制糖尿病是治疗有效的量将部分胰岛素激动剂二聚体给予患者的步骤。在一个实施方案中，部分激动剂胰岛素二聚体包含通过二聚化接头彼此连接的第一和第二胰岛素多肽，其中第一和第二胰岛素多肽各自独立地包含选自以下的胰岛素多肽
i) 包含通过链间二硫键连接的A链和B链的两链胰岛素类似物；和ii)包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素类似物，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价结合，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价结合。在一个实施方案中，A链包含GIVX4X5CCX8X9X10CX12LX14X15LEX18X19CX21-R13 (SEQ ID NO: 70)的序列，B链包含X25LCGX29X30LVX33X34LYLVCGX41X42GFX45 (SEQ ID NO: 44)的序列；和
a) 通过相应的第一和第二胰岛素多肽B29位处的氨基酸的侧链彼此连接的第一和第二胰岛素多肽；
b) 所述第一和第二胰岛素多肽的至少一个是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过所述第一和第二胰岛素多肽之一的B1位处的氨基酸的侧链和所述连接部分的氨基酸的侧链彼此连接；或
c) 第一和第二胰岛素多肽两者是单链胰岛素多肽，且第一和第二胰岛素多肽通过相应的第一和第二胰岛素多肽的连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。有利的是，部分激动剂二聚体显示最大剂量反应降低，因此申请人预期在给予患者时所述部分激动剂二聚体可降低低血糖的风险。
在又一个实施方案中，提供对亚型B胰岛素受体(IR-B)有选择性的胰岛素二聚体。申请人发现，在相对于天然胰岛素显示较高IR-A/IR-B比率(即相对于IR-B对IR-A的亲和力较高)的基于胰岛素的多肽和多肽(例如IGF I或IGF II)之间形成的二聚体显示对IR-B活化有优先，如相对于IR-A对IR-B的较高水平的最大受体反应所指示的。在一个实施方案中，提供对亚型B胰岛素受体有选择性的胰岛素二聚体。在一个实施方案中，二聚体包含第一和第二胰岛素多肽，其每一个是包含A链、B链和连接部分的单链胰岛素多肽，其中所述连接部分的第一末端与B链的羧基端共价连接，且所述连接部分的第二末端与A链的氨基端共价连接，其中
第一胰岛素多肽包含
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1)的A链序列；
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 2)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第一连接部分，和
第二多肽包含
TPAX75SEGIVEECCFRSCDLALLETYCA (SEQ ID NO: 88)或GIVDECCFRSCDLRRLEMYCA (SEQ ID NO: 5)的A链序列；
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPA (SEQ ID NO: 87)或GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPT (SEQ ID NO: 10)的B链序列；和
包含选自PEG8-K-PEG4和GYGSSSRX68APQT (SEQ ID NO: 9)的序列的第二连接部分，其中
X68为精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸或包含以下结构I的侧链的氨基酸：
；
X75为赖氨酸或精氨酸；m为选自1-4的整数，R15为H或NH2，而且其中
第一和第二胰岛素多肽通过(i)所述第一或第二胰岛素多肽之一的N端氨基酸的N端胺或侧链和另一个胰岛素多肽的连接部分的侧链或(ii)第一和第二胰岛素多肽各自相应的连接部分的氨基酸的侧链彼此连接。
附图简述
图1是制备人胰岛素的两步合成策略的示意图。实施例1提供所述程序的细节。
图2是比较合成人胰岛素相对于纯化天然胰岛素的胰岛素受体特异性结合的曲线图。通过图1详细描述的方法生产合成胰岛素，其中A7-B7键是所形成的第一个二硫键。如曲线图中提供的数据所示，两种分子具有相似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和IGF1(YB16LB17)类似物的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据所示，两种分子具有类似的结合活性。
图4是人胰岛素原(A链，SEQ ID NO: 1；B链，SEQ ID NO: 2和C链，SEQ ID NO: 92)和胰岛素样生长因子I和II (IGF I；SEQ ID NO: 3和IGF II；SEQ ID NO: 4)氨基酸序列的比对。比对表明这3种肽共有高水平的序列同一性(*表明无相应氨基酸的空区，短线(-)表明存在于胰岛素中的相同氨基酸)。
图5A和5B是描述前药dK,(N-异丁基G)-IGF1YL (SEQ ID NO: 86，通过A19 4-氨基Phe连接的二肽)的体外活性的曲线图。图5A是比较在PBS中温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间(0小时、5小时和52小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。图5B是比较在20%血浆/PBS中在37℃下温育的天然胰岛素和A19 IGF前药衍生物(IGF1YL：dK,(N-异丁基G)随时间(0小时、3.6小时和24.8小时)的相对胰岛素受体结合的曲线图。如曲线图中提供的数据所示，当前药形式转化为有活性的IGF1YL肽时，从A19 IGF前药衍生物样品恢复的活性提高。
图6是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图。对天然IGF-1 C肽(010)相对于C肽连接部分中各种氨基酸取代或缺失的活性进行了比较。在B0C1A0胰岛素类似物命名中，B0和A0标识是指A链和B链的天然胰岛素序列，而C1表示IGF-1 C肽。
图7是描述单链B0C1A0胰岛素类似物对A亚型胰岛素的相对体外结合活性和磷酸化活性的柱状图，其中连接性IGF-1 C肽的天然序列在1、2、3、4或8位处被标示的氨基酸取代修饰。该数据结合图8提供的数据表明胰岛素类似物的结合和磷酸化活性之间的一致性。
图8A-8C涉及使用PEG聚合物作为连接部分的单链胰岛素类似物。图8A是显示使用PEG聚合物作为连接部分的IGF-1 YL单链胰岛素类似物的制备的示意图。图8B和8C是描述通过4、8或16单体PEG连接部分连接的单链胰岛素类似物相对于天然胰岛素异源双链体的相对体外结合活性(图8B)和磷酸化活性(图8C)的曲线图。
图9A-9D是显示在小鼠中进行的比较胰岛素耐量试验结果的曲线图，比较了人胰岛素相对于3种不同的酰化胰岛素类似物降低并维持低血糖浓度的能力。测试了两种不同浓度的多肽(27 nmol/kg和90 nmol/kg)。酰化胰岛素包括MIU-41、MIU-36和MIU-37。MIU-41 [B1(H5,H10,Y16,L17)26A:A1(H8,rEC16-K14,N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有通过与位于A14位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。MIU-36 [B1(C16-K0,H5,H10,Y16,L17)26A:A1(N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有与B链N端连接的C16酰化。MIU-37 [B1(H5,H10,Y16,L17,C16rE-K22)26A:A1(N18,N21)]是一种两链胰岛素类似物，具有通过与位于B22位的赖氨酸残基连接的γ谷氨酸接头的C16酰化。
图10A-10D表示使用C57/Blk小鼠从对Detemir和MIU-56的比较胰岛素耐量试验中得到的结果。MIU-56是胰岛素单链类似物B1(H5,Y16,L17)26A-PEG8-K-PEG4-A1(N18,21)，其包含与连接A链和B链的连接部分(PEG8-K-PEG4)中的单一赖氨酸残基侧链连接的20 kDa PEG。图10A和10B是显示胰岛素耐量试验结果的曲线图，其比较了酰化胰岛素类似物Detemir相对于聚乙二醇化单链胰岛素类似物MIU-56降低和保持低血糖水平的能力。图10C和10D分别显示给予Detemir和MIU-56的小鼠的血糖AUC24小时。
图11A-11E。测试了B29-B29’胰岛素二聚体(多肽#51，通过B链的B29赖氨酸侧链间的二硫键连接在一起的2个天然胰岛素多肽间所形成的二聚体)对A型胰岛素受体的受体活性(参见图11A)；通过磷酸化测定法的B型胰岛素受体(参见图11B)和IGF-1受体(参见图11C)和通过体外HMEC增殖测定法测试的促有丝分裂性(参见图11D)。曲线图中的实线表示：通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#51 (◆)刺激的A型或B型受体磷酸化(分别于图11A-11B)；短划线表示：通过共温育6 nM胰岛素和标示浓度的胰岛素(■)或#51 (◆)刺激的A型或B型受体磷酸化(分别于图11A-11B)。B29-B29’胰岛素二聚体相对于天然胰岛素对胰岛素和IGF受体的最大剂量反应略降低(约60%)。图11E显示B29-B29’胰岛素的结构。该二聚体相对于天然胰岛素被修饰，在于A链和B链的N端被氨基甲酰化以及B29位的赖氨酸允许巯基接头连接用于在B29处形成二硫键。两个胰岛素多肽各自包含通过未显示但以二聚体形式存在的天然胰岛素二硫键(A6-A11、A7-B7、A20-B19)彼此连接的天然的人胰岛素A链和B链。
图12A和12B提供得自B29-B29’胰岛素二聚体(图12B)相对于天然胰岛素(图12A)的比较胰岛素剂量滴定的数据。以3种剂量(6 nmole/kg、18 nmole/kg和72 nmole/kg)给予天然胰岛素，以3种较高的剂量(18 nmole/kg、72 nmole/kg和144 nmole/kg)给予B29-B29’胰岛素二聚体。与天然胰岛素类似，B29-B29’胰岛素二聚体降低血糖水平，但是B29-B29’胰岛素二聚体对于葡萄糖的起始降低不太急剧，并保持血糖水平在比天然胰岛素所见的甚至更平稳的状态下。
图13A-13C表明B1-B1’胰岛素二聚体的体外胰岛素活性。图13A显示B1-B1’胰岛素二聚体的合成，其中两个单链胰岛素类似物通过经由B1氨基酸侧链的二硫键连接。初始二聚体是无活性的，因为A链与B链的羧基端直接连接。然而在用胰蛋白酶切割单链实体时，便将单链胰岛素类似物转化成两链胰岛素类似物，并形成包含两链胰岛素多肽的胰岛素二聚体，活性恢复，图13B显示天然胰岛素、B1-B1’胰岛素二聚体(在用胰蛋白酶切割后)和B29-B29’胰岛素二聚体对A型胰岛素受体的相对体外活性。B1-B1’胰岛素二聚体(在用胰蛋白酶切割后)是完全胰岛素激动剂，比天然胰岛素具有更大效能。如图13C所示，B1-B1’胰岛素二聚体对A型和B型胰岛素受体两者具有活性，组氨酸置换B22位的天然精氨酸对活性没有显著影响。
图14A-14C表示从使用C57/Blk小鼠的B1-B1’和B29-B29’胰岛素二聚体的比较胰岛素耐量试验获得的结果。以12或60 nmole/kg的剂量给予人胰岛素(图14A)；以12、60或300 nmole/kg的剂量给予B1-B1’胰岛素二聚体和B29-B29’胰岛素二聚体(分别为图14B和14C)。体内实验结果显示，B1-B1’胰岛素二聚体的效能显得是天然胰岛素的约5倍(12 nmole/kg B1-B1’胰岛素二聚体的葡萄糖降低特征与60 nmole/kg天然胰岛素的大致相当)。或者，B29-B29’胰岛素二聚体的效能显得只是天然胰岛素的约20% (60 nmole/kg天然胰岛素的葡萄糖降低特征与300 nmole/kg B29-B29’胰岛素二聚体大致相当)。
图15A和15B提供从聚乙二醇化单体和IFG 1单链胰岛素类似物的聚乙二醇化B1-B1'二聚体的胰岛素耐量试验获得的数据。该二聚体包含两个单链胰岛素多肽，其各自包含通过C1肽(C肽被修饰以在8位含有赖氨酸)连接的A链和B链，其中两个胰岛素多肽通过连接两个相应胰岛素多肽的N端氨基酸的PEG 20二聚化接头连接。测量了将多肽#39 (GlyB2-PEG20K单体；参见图15A)和多肽#57 (GlyB2-PEG20K-GlyB2二聚体；参见图15B)给予正常小鼠后血糖水平的24小时时间概况。
图16A-16C表明两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物间形成的胰岛素激动剂二聚体的体外胰岛素活性，其中包含二聚体的第一和第二胰岛素激动剂类似物多肽各自具有A链、B链和C肽，其中A链的N端通过C肽与B链的C端连接，且两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物通过2个C8氨基酸侧链间的二硫键彼此连接。图16A显示C8-C8’ IGF-1类似物二聚体的通用结构。图16B显示C8-C8’ IGF-1类似物二聚体对亚型A胰岛素受体的体外活性的结果。相对于天然胰岛素，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体的最大剂量反应略降低(约75%) (参见图16B,▼)。而且，在较高浓度下(例如大于1 nmole/kg)，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体具有拮抗剂性质(参见图16B，●)。图16C表明相对于IGF-1受体，C8-C8’ IGF-1类似物二聚体保持对胰岛素受体的选择性。
图17A-17D显示包含两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性，其中A链和B链通过mini-peg连接部分(PEG8-K-PEG4)连接，且两个胰岛素多肽通过各自的连接部分的赖氨酸侧链连接(B1[[H5Y16L17]25-PEG8KPEG4-A1[N18,21]的LysC8-LysC8二聚体；多肽#53)。通过磷酸化测定法测试了对亚型A胰岛素受体(参见图17A)、亚型B胰岛素受体(参见图17B)和IGF-1受体的活性(参见图17C)，并通过体外亚型A胰岛素受体结合测定法测试了受体结合亲和力(参见图17D)。曲线图中的实线表示：通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图17A-17B)；短划线表示：通过共温育6 nM胰岛素和标示浓度的胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图17A-17B)。
图18A和18B表明包含两个单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性，其中A链和B链通过经修饰以在C肽8位含有赖氨酸的C1肽连接，其中两个胰岛素多肽通过各自的连接部分的赖氨酸侧链连接(B1[[H5,10Y16L17]25-C1[K8]-A1[H8N18,21]的LysC8-LysC8二聚体；多肽#54)。通过体外磷酸化测定法测试了对亚型A胰岛素受体(参见图18A)和亚型B胰岛素受体(参见图18B)的活性。显示了通过标示浓度的天然胰岛素(■)或#53 (●)刺激的亚型A或亚型B受体磷酸化(分别于图18A-18B)。
图19A-19D表明包含两个IGF-1胰岛素激动剂类似物的胰岛素二聚体的活性。图19A提供通过第一无活性的胰岛素聚合物的N端氨基酸的侧链和第二单链IGF-1胰岛素激动剂类似物的C8氨基酸的侧链间形成的二硫键在第一无活性的胰岛素多肽和第二胰岛素聚合物之间形成的胰岛素二聚体的结构。所述第一胰岛素多肽是无活性的，因为A链与B链直接融合。如图19B中提供的数据所示，该多肽是胰岛素拮抗剂。
胰岛素类似物二聚体专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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