专利摘要

本发明涉及包括偶连于C末端的N末端的嵌合蛋白，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。本发明还涉及包括根据本发明的嵌合蛋白的药物组合物，用于治疗患有糖尿病、肥胖症或代谢综合征的受试者的方法，和筛选具有增强的针对βKIotho-FGF受体复合物的结合亲和力的化合物的方法，所述方法涉及本发明的嵌合蛋白的使用。

权利要求

1.一种嵌合蛋白，其包含：

偶连于C末端的N末端，其中所述N末端包含旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且所述C末端包含FGF21分子的C末端部分，以及其中所述旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

2.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述旁分泌FGF为FGF1或FGF2。

3.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述旁分泌FGF的所述部分包含始于SEQ ID NO:1的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列。

4.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述旁分泌FGF的所述部分包括始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述旁分泌FGF的所述部分包括SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-150、1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-150、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-150、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-150、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-150、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-150、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-150、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-150、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-150、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-150、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-150、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-150、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-150、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-150、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-150、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-150、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-150、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-150、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-150、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、21-150、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

6.根据权利要求4所述的嵌合蛋白，其中所述旁分泌FGF的所述部分包括SEQ ID NO:121的氨基酸残基1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-151、20-152、20-153、20-154、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

7.根据权利要求3所述的嵌合蛋白，其中所述修饰包含位于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。

8.根据权利要求7所述的嵌合蛋白，其中所述一个或多个置换选自N33T、K127D、K128Q、N129T、K133V、R134L、R137H、Q142M、K143T/L/I及其组合。

9.根据权利要求4所述的嵌合蛋白，其中所述修饰包含位于SEQ ID NO:121的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。

10.根据权利要求9所述的嵌合蛋白，其中所述一个或多个置换选自N36T、K128D、R129Q、K134V、K138H、Q143M、K144T/L/I、C78S、C96S及其组合。

11.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述C末端部分包含β-Klotho共受体结合结构域。

12.根据权利要求1所述的嵌合蛋白，其中所述C末端部分包含SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。

13.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述C末端部分还包含一个或多个缺失或置换，同时保持结合β-Klotho的能力。

14.根据权利要求12所述的嵌合蛋白，其中所述FGF21的C末端部分还包含一个或多个置换、添加或缺失来相较于不具有所述修饰的C末端部分，增强针对β-Klotho的结合亲和力。

15.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的嵌合蛋白和药学上可接受的载体。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其还包含：

一种或多种选自抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和降胆固醇剂的试剂。

17.根据权利要求15所述的药物组合物，其还包含向器官靶向剂。

18.一种用于治疗患有病症的受试者的方法，所述方法包括：

选择患有所述病症的受试者；

提供嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白，其中所述嵌合FGF蛋白包含偶连于C末端的N末端，其中所述N末端包含旁分泌FGF的一部分并且所述C末端包含FGF21的C末端部分，以及其中所述旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力；和

在对于治疗所述病症是有效的条件下给选择的受试者施用治疗有效量的嵌合FGF蛋白。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述旁分泌FGF为FGF1或FGF2。

20.根据权利要求18所述的方法，其中所述旁分泌FGF的所述部分包含始于SEQ ID NO:1的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列。

21.根据权利要求18所述的方法，其中所述旁分泌FGF的所述部分包含始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列。

22.根据权利要求20所述的方法，其中所述旁分泌FGF的所述部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-150、1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-150、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-150、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-150、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-150、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-150、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-150、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-150、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-150、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-150、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-150、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-150、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-150、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-150、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-150、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-150、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-150、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-150、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-150、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、21-150、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

23.根据权利要求21所述的方法，其中所述旁分泌FGF的所述部分包含SEQ ID NO:121的氨基酸残基1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-151、20-152、20-153、20-154、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

24.根据权利要求20所述的方法，其中所述修饰包含位于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N33T、K127D、K128Q、N129T、K133V、R134L、R137H、Q142M、K143T/L/I及其组合。

26.根据权利要求21所述的方法，其中所述修饰包含位于SEQ ID NO:121的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N36T、K128D、R129Q、K134V、K138H、Q143M、K144T/L/I、C78S、C96S及其组合。

28.根据权利要求18所述的方法，其中所述C末端部分包含β-Klotho共受体结合结构域。

29.根据权利要求18所述的方法，其中所述C末端部分包含SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。

30.根据权利要求29所述的方法，其中FGF21的C末端部分还包含一个或多个置换、添加或缺失，同时保持结合β-Klotho的能力。

31.根据权利要求29所述的方法，其中FGF21的C末端部分还包含一个或多个置换、添加或缺失来相较于不具有所述修饰的C末端部分，增强针对β-Klotho的结合亲和力。

32.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症选自糖尿病、肥胖症和代谢综合征。

33.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是II型糖尿病、妊娠糖尿病或药物引起的糖尿病。

34.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是I型糖尿病。

35.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是肥胖症。

36.根据权利要求18所述的方法，其中所述病症是代谢综合征。

37.根据权利要求18所述的方法，其中所述施用通过胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹膜内途径，通过鼻内滴注，通过植入，通过腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病变内、经皮肤途径，或通过对粘膜的敷用来进行。

38.根据权利要求18所述的方法，其中将所述嵌合FGF蛋白与药学上可接受的载体一起施用。

39.根据权利要求18所述的方法，其中所述选择的受试者为哺乳动物。

40.根据权利要求18所述的方法，其中所述选择的受试者为人。

41.根据权利要求18所述的方法，其中将所述嵌合FGF与一种或多种试剂共施用，所述试剂选自抗炎剂、抗纤维化剂、抗高血压剂、抗糖尿病剂、降甘油三酯剂和降胆固醇剂。

42.一种产生具有增强的内分泌活性的嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白的方法，所述方法包括：

将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中所述修饰减小所述FGF蛋白针对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力；和

将Klotho共受体结合结构域偶连于所述修饰FGF蛋白的C末端，由此产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF蛋白。

43.根据权利要求42所述的方法，其还包括：

在所述偶连之前，选择Klotho共受体结合结构域，其中所述Klotho共受体结合结构域被选择来靶向内分泌FGF靶组织。

44.根据权利要求42所述的方法，其中所述嵌合FGF蛋白具有比具有所述Klotho共受体结合结构域的天然内分泌FGF配体更大的针对FGF受体(“FGFR”)的结合亲和力。

45.根据权利要求42所述的方法，其中所述FGF蛋白为旁分泌FGF。

46.根据权利要求45所述的方法，其中所述FGF蛋白为FGF1或FGF2。

47.根据权利要求42所述的方法，其中所述FGF蛋白包含始于SEQ ID NO:1的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列。

48.根据权利要求42所述的方法，其中所述FGF蛋白包含始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列。

49.根据权利要求47所述的方法，其中所述FGF蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-150、1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-150、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-150、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-150、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-150、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-150、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-150、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-150、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-150、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-150、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-150、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-150、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-150、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-150、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-150、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-150、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-150、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-150、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-150、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、21-150、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述FGF蛋白包含SEQ ID NO:121的氨基酸残基1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-151、20-152、20-153、20-154、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

51.根据权利要求47所述的方法，其中所述修饰为位于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N33T、K127D、K128Q、N129T、K133V、R134L、R137H、Q142M、K143T/L/I及其组合。

53.根据权利要求48所述的方法，其中所述修饰为位于SEQ ID NO:121的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N36T、K128D、R129Q、K134V、K138H、Q143M、K144T/L/I、C78S、C96S及其组合。

55.根据权利要求42所述的方法，其中所述Klotho共受体结合结构域包含FGF21的C末端部分。

56.根据权利要求39所述的方法，其中所述Klotho共受体结合结构域包含β-Klotho共受体结合结构域。

57.根据权利要求39所述的方法，其中FGF21的C末端部分包含SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。

58.根据权利要求55所述的方法，其中FGF21的C末端部分还包含一个或多个置换、添加或缺失，同时保持结合β-Klotho的能力。

59.根据权利要求55所述的方法，其中FGF21的C末端部分还包含一个或多个置换、添加或缺失来相较于不具有所述修饰的C末端部分，增强针对β-Klotho的结合亲和力。

60.一种有利于成纤维细胞生长因子受体(“FGFR”)-βKlotho共受体复合物形成的方法，所述方法包括：

提供包含βKlotho共受体和FGFR的细胞；

提供包含FGF21的C末端部分和旁分泌FGF的一部分的嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白，其中所述旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力；和

在对于引起FGFR-βKlotho共受体复合物形成是有效的条件下将所述细胞与嵌合FGF蛋白接触。

61.根据权利要求60所述的方法，其中所述旁分泌FGF为FGF1或FGF2。

62.根据权利要求60所述的方法，其中所述旁分泌FGF蛋白的所述部分包括始于SEQ ID NO:1的残基1至25的任一个并终于残基150至155的任一个的氨基酸序列。

63.根据权利要求60所述的方法，其中所述旁分泌FGF蛋白的所述部分包括始于SEQ ID NO:121的残基1至25的任一个并终于残基151至155的任一个的氨基酸序列。

64.根据权利要求62所述的方法，其中所述旁分泌FGF蛋白的所述部分包含SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-150、1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-150、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-150、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-150、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-150、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-150、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-150、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-150、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-150、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-150、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-150、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-150、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-150、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-150、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-150、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-150、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-150、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-150、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-150、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-150、20-151、20-152、20-153、20-154、21-150、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-150、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-150、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-150、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-150、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述旁分泌FGF蛋白的所述部分包含SEQ ID NO:121的氨基酸残基1-151、1-152、1-153、1-154、1-155、2-151、2-152、2-153、2-154、2-155、3-151、3-152、3-153、3-154、3-155、4-151、4-152、4-153、4-154、4-155、5-151、5-152、5-153、5-154、5-155、6-151、6-152、6-153、6-154、6-155、7-151、7-152、7-153、7-154、7-155、8-151、8-152、8-153、8-154、8-155、9-151、9-152、9-153、9-154、9-155、10-151、10-152、10-153、10-154、10-155、11-151、11-152、11-153、11-154、11-155、12-151、12-152、12-153、12-154、12-155、13-151、13-152、13-153、13-154、13-155、14-151、14-152、14-153、14-154、14-155、15-151、15-152、15-153、15-154、15-155、16-151、16-152、16-153、16-154、16-155、17-151、17-152、17-153、17-154、17-155、18-151、18-152、18-153、18-154、18-155、19-151、19-152、19-153、19-154、19-155、20-151、20-152、20-153、20-154、21-155、21-151、21-152、21-153、21-154、21-155、22-151、22-152、22-153、22-154、22-155、23-151、23-152、23-153、23-154、23-155、24-151、24-152、24-153、24-154、24-155、25-151、25-152、25-153、25-154或25-155。

66.根据权利要求62所述的方法，其中所述修饰为位于SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N33、K127、K128、N129、K133、R134、R137、Q142、K143及其组合。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N33T、K127D、K128Q、N129T、K133V、R134L、R137H、Q142M、K143T/L/I及其组合。

68.根据权利要求63所述的方法，其中所述修饰为位于SEQ ID NO:121的一个或多个氨基酸残基上的一个或多个置换，所述氨基酸残基选自N36、K128、R129、K134、K138、Q143、K144、C78、C96及其组合。

69.根据权利要求68所述的方法，其中所述一个或多个置换选自N36T、K128D、R129Q、K134V、K138H、Q143M、K144T/L/I、C78S、C96S及其组合。

70.根据权利要求60所述的方法，其中所述Klotho为β-Klotho共受体蛋白。

71.根据权利要求60所述的方法，其中所述FGFR为FGFR1c、FGFR2c或FGFR4。

72.根据权利要求60所述的方法，其中所述C末端部分包含β-Klotho共受体结合结构域。

73.根据权利要求60所述的方法，其中来自FGF21的C末端部分包含SEQ ID NO:233的氨基酸残基168-209。

74.根据权利要求73所述的方法，其中来自FGF21的C末端部分包含一个或多个置换、添加或缺失，同时保持结合β-Klotho的能力。

75.根据权利要求73所述的方法，其中来源于FGF21的C末端部分包含一个或多个置换、添加或缺失来相较于无所述置换、添加或缺失的部分，增强针对β-Klotho的结合亲和力。

76.一种方法，所述方法用于筛选能够在病症的治疗中有利于成纤维细胞生长因子受体(“FGFR”)-βKlotho复合物形成的试剂，所述方法包括：

提供包含偶连于C末端的N末端的嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)，其中所述N末端包含旁分泌FGF的一部分并且所述C末端包含FGF21的C末端部分，以及其中所述旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力；

提供二元βKlotho-FGFR复合物；

提供一种或多种候选试剂；

在这样的条件下将所述嵌合FGF、所述二元βKlotho-FGFR复合物与所述一种或多种候选试剂组合，所述条件允许在一种或多种候选试剂不存在的情况下在所述嵌合FGF与所述二元βKlotho-FGFR复合物之间形成三元复合物；和

将所述一种或多种候选试剂鉴定为适合用于治疗所述病症，所述候选试剂相较于在一种或多种候选试剂不存在的情况下的三元复合物形成，减少所述嵌合FGF与所述二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物形成。

77.根据权利要求76所述的方法，其中所述旁分泌FGF为FGF1或FGF2。

78.根据权利要求76所述的方法，其中所述调节为所述嵌合FGF与所述一个或多个候选试剂之间对结合所述二元βKlotho-FGFR复合物的竞争性相互作用。

79.根据权利要求76所述的方法，其中所述调节稳定所述三元复合物。

80.根据权利要求76所述的方法，其中所述调节为变构调节或动力学调节。

81.根据权利要求76所述的方法，其中所述FGFR为FGFR1c、FGFR2c或FGFR4。

82.根据权利要求76所述的方法，其中提供多个候选试剂。

83.根据权利要求76所述的方法，其中使用表面等离子体共振光谱进行所述鉴定。

84.根据权利要求76所述的方法，其中所述病症选自糖尿病、肥胖症和代谢综合征。

说明书

本申请要求2012年6月7日提交的美国临时专利申请No.61/656,778、2012年6月25日提交的美国临时专利申请No.61/664,081和2013年3月15日提交的美国专利申请系列No.13/837,880的优先权利益，将所述美国临时专利申请或美国专利申请系列的每一个案子通过引用全文并入本文。

本发明是利用在由美国国立卫生研究院授予的基金号DE13686、DK077276、AG019712、DK091392和DK067158下的政府资助进行的。政府在本发明中具有某些权利。

发明领域

本发明涉及嵌合成纤维细胞生长因子(“FGF”)蛋白及其用途。

发明背景

2型糖尿病是慢性进行性病症，其由与胰腺的不充足胰岛素分泌组合的终末器官对胰岛素的作用的抵抗引起。与胰岛素抗性和分泌缺陷相关的代谢异常，特别地高血糖症在数年的过程中导致对多个器官包括心脏、血管、肾和眼的广泛的不可逆转的损伤。目前，将近2亿或2.9％的世界人口具有2型糖尿病(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月；Wild等人，“Global Prevalence of Diabetes:Estimates for the Year 2000and Projections for 2030,”Diabetes Care 27(5):1047-1053(2004))，其流行正以令人担忧的快速步伐上升，与之并行的是超重和肥胖症流行的上升(世界卫生组织，Diabetes and Overweight Fact Sheet N°311,2011年1月)。直至20世纪末，仅在成人中观察到2型糖尿病，但曾经称为“成年型糖尿病”的2型糖尿病现也在儿童和青少年中得到诊断，该日益增加的发病率可能与儿童和青少年中的超重和肥胖症的增加相关。前期糖尿病(正常葡萄糖动态平衡与糖尿病之间的中间代谢期)的流行甚至比2型糖尿病的流行更普遍。目前，仅在美国就有接近8000万或26％的人口具有前期糖尿病(疾病预防控制中心，National Diabetes Fact Sheet2011)，这样就处于进展至2型糖尿病的高风险中。2型糖尿病列于世界死亡的10个首要原因之列，世界卫生组织预计在下一个10年内因糖尿病(其90％为2型)引起的死亡率将超过2倍(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)。2型糖尿病也是失能的主要原因。作为糖尿病视网膜病变的结果，世界上约10％的所有糖尿病患者发生严重性视觉病症，并且2％失明在15年内形成疾病(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)。在世界范围内影响高达一半的所有糖尿病患者(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月)的糖尿病神经病变占据大部分非创伤性下肢截肢。事实上，在其最近公布的关于非传染性疾病的第一世界报告中，世界卫生组织认为糖尿病与其它慢性非传染性疾病如癌症和心脏病一起是全球经济和社会负担，其超过因传染性疾病例如HIV/AIDS施加的负担。

2型糖尿病的当前药物疗法集中在纠正患者的高血糖症。虽然许多具有不同抗高血糖作用机制的小分子和生物制品可获得用作单一疗法或联合治疗，这些药物的大多数(如果不是全部的话)具有有限的功效、有限的耐受性和显著的有害效应(Moller,“New Drug Targets f or Type 2Diabetes and the Metabolic Syndrome,”Nature 414(6865):821-827(2001))。例如，利用磺脲类、格列奈、噻唑啉二酮或胰岛素的治疗与体重增长相关，这是不期望的作用，因为超重被认为是2型糖尿病发病机制的驱动力。这些治疗中的一些治疗也与增加的低血糖症风险相关。对噻唑啉二酮的特殊限制是有可能引起不利的心血管效应(DeSouza等人，“Therapeutic Targets to Reduce Cardiovascular Di sease in Type 2Diabetes,”Nat Rev Drug Discov 8(5):361-367(2009))。关于噻唑烷二酮类药物罗格列酮( )(其被广泛用于2型糖尿病的治疗)的临床数据的元分析发现药物增加2型糖尿病患者的心肌梗塞的风险(Nissen等人，“Effect of Rosiglitazone on the Risk of Myocardial Infarction and Death from Cardiovascular Causes,”NE ngl J Med 356(24):2457-2471(2007))。在所有糖尿病并发症中，心血管疾病是糖尿病患者的发病率和死亡率的主要原因(世界卫生组织，Diabetes Fact Sheet N°312,2011年1月国；疾病预防控制中心，National Diabetes Fact Sheet 2011)，因此药物治疗对心血管风险的加重是绝对不可接受的。在噻唑啉二酮的心血管安全的辩论之后不久，FDA颁布了关于评价治疗2型糖尿病的新型抗糖尿病疗法的心血管危险的指导(Opar A,“Diabetes Drugs Pass Cardiovascular Risk Check,”Nat Rev Drug Discov 8(5):343-344(2009))。同时，噻唑啉二酮失去了它们的受欢迎程度。即使对于胰高血糖素样肽1激动剂，被引入用于治疗2型糖尿病的最新种类的药物之一，已引起关于安全性的关注，即致癌性的潜能(Opar A,“Diabetes Drugs Pass Cardiova scular Risk Check,”Nat Rev Drug Discov 8(5):343-344(2009))。因此，需要比现有药物更有效更安全的新型疗法。由于目前可用的药物不直接靶向晚期糖尿病的并发症，特别地心血管疾病，因此特别期望不仅在降低血糖上有效而且还降低心血管风险因子例如血脂异常的疗法。

由Eli Lilly&Co.进行的关于治疗2型糖尿病的潜在新型生物治疗剂的研究导致作为以不依赖胰岛素的方式刺激葡萄糖至脂细胞的吸收的蛋白的成纤维细胞生长因子(FGF)21的发现(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005))。FGF21此后出现为不仅葡萄糖代谢而且还有脂质代谢的至关重要的内分泌调节剂，并且已成为用于治疗2型糖尿病、肥胖症和代谢综合征的最有前景的药物候选者之一。在糖尿病和肥胖症的小鼠模型中，药物剂量的FGF21降低血糖，增强葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，并且增强了胰腺β-细胞功能(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth factor 21corre cts obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008)；Wen te等人，“Fibroblast Growth Factor-21Improves Pancreatic Beta-Cell Function and Survival by Activation of Extracellular Signal-Regulat ed Kinase 1/2and Akt Signaling Pathways,”Diabetes 55:2470-2478(2006))。同时，FGF21降低血浆甘油三酯和胆固醇，增强脂解和抑制脂肪生成，加带能量消耗，和逆转脂肪肝疾病(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth factor 21corrects obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008)；Xu等人，“Fibroblast Growth Factor 21Reverses Hepatic Steatosis,Increa ses Energy Expenditure,and Improves Insulin Sensitivity in Diet-In duced Obese Mice,”Diabetes 58:250-259(2009))。在肥胖小鼠中，F GF21引起体重减轻，在瘦小鼠中，其为对体重具有中性作用(Kharit onenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin In vest 115(6):1627-1635(2005)；Coskun等人，“Fibroblast growth facto r 21corrects obesity in mice,”Endocrinology 149(12):6018-6027(2008))。因此，FGF21具有一些用于治疗2型糖尿病的药物的最期望的特征；其不仅增强血糖控制，而且还直接影响心血管危险因子，例如高甘油三酯血症，和减轻肥胖，所述肥胖被认为是2型糖尿病的单一最重要促进因子。重要地，FGF21不诱发低血糖症(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005))，其为可随几种目前的抗糖尿病疗法包括胰岛素发生的副作用。此外，FGF21在小鼠中未显示任何有丝分裂促进活性(Kharitonenkov等人，“FGF-21as a Novel Metabolic Regulator,”J Clin Invest 115(6):1627-1635(2005))，从而排除致癌危险性的可能性。在糖尿病小鼠模型中关于FGF21疗法的发现已在糖尿病恒河猴中重现(Kharitonenkov等人，“The Metabolic State of Diabetic Monk eys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21,”Endocrinology 148(2):774-781(2007))，并且在人中目前通过临床试验进行随访(Kharit onenkov等人，“FGF21Reloaded:Challenges of a Rapidly Growing Field,”Trends Endocrinol Metab 22(3):81-86(2011))。FGF21疗法还导致促炎细胞因子的血清水平的降低，这可促成增强的胰岛素敏感性(Kharitonenkov等人，“The Metabolic State of Diabetic Monkeys is Regulated by Fibroblast Growth Factor-21,”Endocrinology 148(2):774-781(2007))并且还可能赋予FGF21抗动脉粥样硬化性质。然而，仍然存在对更有效的FGF21治疗剂的需要。

本发明克服了本领域的这些和其它不足。

发明概述

本发明的一个方面涉及嵌合蛋白。嵌合蛋白包括偶连于C末端的N末端，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于无修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

本发明的另一个方面涉及用于治疗患有病症的受试者的方法。该方法包括选择患有病症的受试者和提供嵌合FGF蛋白，其中嵌合FGF蛋白包括偶连于C末端的N末端。N末端包括旁分泌FGF的一部分并且C末端包括FGF21的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于无修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括在对于治疗病症是有效的条件下给选择的受试者施用治疗有效量的嵌合FGF蛋白。

本发明的另一个方面涉及产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF蛋白的方法。该方法包括将一个或多个修饰引入FGF蛋白，其中修饰减小FGF蛋白对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力并将Klotho共受体结合结构域偶连于修饰FGF蛋白的C末端，由此产生具有增强的内分泌活性的嵌合FGF。

本发明的另一个方面涉及有利于成纤维细胞生长因子受体(“FGFR”)-βKlotho共受体复合物形成的方法。该方法包括提供包括βKlotho共受体和FGFR的细胞和提供嵌合FGF蛋白。嵌合FGF蛋白包括FGF21的C末端和旁分泌FGF的一部分，其中旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分减小针对肝素和/或硫酸类肝素的亲和力。该方法还包括在对于引起FGFR-βKlotho共受体复合物形成是有效的条件下将细胞与嵌合FGF蛋白接触。

然而本发明的其它方面涉及筛选能够在病症的治疗中有利于FGFR-βKlotho复合物形成的试剂的方法。该方法包括提供包括偶连于C末端的N末端的嵌合FGF，其中N末端包括旁分泌FGF的一部分，并且C末端包括FGF21的C末端。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。该方法还包括提供二元βKlotho-FGFR复合物和提供一种或多种候选试剂。该方法还包括在这样的条件下组合嵌合FGF、二元βKlotho-FGFR复合物与一种或多种候选试剂，所述条件允许在所述一种或多种候选试剂不存在的情况下形成嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物。该方法还包括将一种或多种候选试剂鉴定为适合用于治疗病症，所述候选试剂相较于在一种或多种候选试剂不存在的情况下的二元复合物形成，减少嵌合FGF与二元βKlotho-FGFR复合物之间的三元复合物形成。

成纤维细胞生长因子(FGF)19、21和23为以Klotho共受体依赖性方式调节主要代谢过程例如葡萄糖和脂质代谢(FGF21)以及磷酸盐和维生素D动态平衡(FGF23)的激素。硫酸类肝素糖胺聚糖在内分泌FGF的细胞表面信号复合物的形成中的作用还不清楚。为破译HS在内分泌FGF信号转导中的作用，我们产生缺乏HS结合的FGF19和FGF23突变型配体，并将它们的信号转导能力与野生型配体的相比较。本文中提供的数据显示突变配体保持完全代谢活性，从而证明HS不参与内分泌FGF信号复合物的形成。此处显示硫酸类肝素不是FGF19和FGF23的信号转导单位的组分。通过减小旁分泌FGF的硫酸类肝素结合亲和力，并用其C末端尾替代包含Klotho共受体结合位点的内分泌FGF的C末端尾以使配体回到靶组织中来将旁分泌FGF转化成内分泌配体。配体转为工程化内分泌FGF-样分子以治疗代谢病症，包括全球流行病例2型糖尿病和肥胖症提供新型策略。

附图简述

图1A-1D为显示FGF2、FGF19和FGF23的HS结合位点的并排比较以及内分泌FGF信号转导复合物的两个工作模型的示意图。图1A显示在2:2FGF2-FGFR1c二聚体的晶体结构(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))中观察到的FGF2(图示)与肝素己糖(以图棒显示的)的相互作用。肝素己糖由3个1→4连接的N-硫酸化-6-O-硫酸化D-葡糖胺和2-O-硫酸化L-艾杜糖醛酸的二糖单位组成。注意，肝素己糖与FGF2的HS结合位点中的残基的侧链和骨架原子相互作用。虚线表示氢键。将与肝素己糖产生大部分氢键的K128、R129和K134加框。β-链命名遵循最初的FGF1和FGF2晶体结构(Ago等人，J.Biochem.110:360-363(1991)；Eriksson等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3441-3445(1991)；Zhang等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.88:3446-3450(1991)；Zhu等人，Science 251:90-93(1991)，将其通过引用全文并入本文)。请注意，相较于在大豆胰蛋白酶抑制剂(PDB ID:1TIE；(Onesti等人，J.Mol.Biol.217:153-176(1991)，将其通过引用全文并入本文))和白细胞介素1β(PDB ID:1I1B；(Finzel等人，J.Mol.Biol.209:779-791(1989)，将其通过引用全文并入本文))中看到的典型β-三叶形折叠，在FGF2和其它旁分泌FGF中配对的β10-β11链界线不太明确。图1B和1C显示了在图1A中以与FGF2结构相同的取向显示的FGF19(PDB ID:2P23；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文))(图1B)和FGF23(PDB ID:2P39；(Goetz等人，Mol.Cell Biol.27:3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文))(图1C)的晶体结构的卡通图示。定位至这些配体的对应HS结合位点的残基的侧链以图棒显示。将FGF19和FGF23中被选择用于诱变以敲除残留HS结合的残基加框。NT和CT表示FGF的N和C末端。图1D为内分泌FGF-FGFR-Klotho共受体信号转导单位的两个工作模型的示意图。关于FGF21、FGFR1c与βKlotho之间的三元复合物形成的研究支持1:2:1模型而非2:2:2模型(Ming等人，J.Biol.Chem.287:19997-20006(2012)，将其通过引用全文并入本文)。为了比较，显示了旁分泌FGF-FGFR-HS信号转导单位的示意图，其是基于2:2:2FGF2-FGFR1c-HS复合物的晶体结构产生的(PDB ID:1FQ9；(Schlessinger等人，Mol.Cell 6:743-750(2000)，将其通过引用全文并入本文))。HS使旁分泌FGF与受体紧密结合以增强FGF对其第一和第二受体的结合，从而促进受体二聚化。问号表示HS是否也是内分泌FGF信号转导复合物的组分。

图2显示了内分泌FGF、FGF1和FGF2的序列比对。将成熟人FGF19、FGF21和FGF23配体的氨基酸序列对齐。还包括在比对中的是FGF1和FGF2(典型旁分泌FGF)的人序列，其用于本文中描述的实验，其中将FGF1和FGF2转化成内分泌FGF配体。对应于FGF1(SEQ ID NO:1)(GenBank登录号AAH32697，将其通过引用全文并入本文)、FGF2(SEQ ID NO:121)(GenBank登录号EAX05222，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)、FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)和FGF23(SEQ ID NO:351)(GenBank登录号AAG09917，将其通过引用全文并入本文)的人序列的残基数目在比对左边的括号中。标记二级结构元件，将包括已知二级结构的这些元件的残基加框。空位(虚线)被引入来最优化序列比对。已知的FGF晶体结构的β-三叶形核心结构域以加以灰色阴影。比对顶部的蓝色条块表示HS结合区域的位置。被选择用于诱变的HS结合残基加以蓝色阴影。

图3A-3G显示与通过定点诱变产生的FGF19和FGF23的残留肝素结合的敲除相关的表面等离子体共振(“SPR”)结果。图3A显示了举例说明FGF2、FGF19、FGF21和FGF23的肝素结合的SPR传感图的叠加(左图框)和FGF19-、FGF21-和FGF23-肝素相互作用的结合反应的分解图(右图框)。将肝素固定在生物传感器芯片上，将400nM的FGF2、FGF19、FGF21或FGF23通过芯片上方。注意，FGF19、FGF21和FGF23显示可测量的残留肝素结合，并且在这三种内分泌FGF之间存在肝素结合的差异。图3B-3D显示举例说明FGF19对肝素的结合的SPR传感图的叠加(图3B)以及FGF19^K149A突变体与肝素之间(图3C)和FGF19^K149A,R157A突变体与肝素之间(图3D)的相互作用的不存在。将肝素固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGF19通过芯片上方。随后，以针对野生型配体测试的最高浓度在肝素芯片上方注射FGF19^K149A或FGF19^K149A,R157A。图3E-3G显示举例说明FGF23对肝素的结合的SPR传感图的叠加(图3E)，FGF23^R48A,N49A突变体与肝素之间的较差相互作用(图3F)以及FGF23^R140A,R143A突变体与肝素之间的相互作用的不存在(图3G)。将肝素固定在生物传感器芯片，将递增浓度的FGF23通过芯片上方。随后以针对野生型配体测试的最高浓度在肝素芯片上方注射FGF23^R48A,N49A或FGF23^R140A,R143A。

图4A-4D显示证明HS不是FGF19和FGF23的代谢活性所必需的结果。图4A显示在利用FGF19^K149A突变体、FGF19^K149A,R157A突变体或野生型FGF19刺激后，H4IIE肝细胞瘤细胞中FRS2α(pFRS2α)和44/42MAP激酶(p44/42MAPK)的磷酸化的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。总44/42MAPK蛋白表达用作上样对照。图4B显示在用FGF23^R48A,N49A突变体、FGF23^R140A,R143A突变体或野生型FGF23刺激后，HEK293-αKlotho细胞系中FRS2α(pFRS2α)和44/42MAP激酶(p44/42MAPK)的磷酸化的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。总44/42MAPK蛋白和αKlotho蛋白表达表达用作上样对照。图4C显示了用FGF19^K149A、FGF19^K149A,R157A、FGF19或媒介物处理的小鼠的肝组织中CYP7A1和CYP8B1mRNA表达的定量分析的图表结果。提供1mg蛋白质/kg体重。数据表示平均值+SEM；***,P<0.001，利用学生氏t检验。图4D显示在FGF23^R48A,N49A、FGF23^R140A,R143A、FGF23或媒介物注射之前和注射后8h小鼠中血清磷酸盐浓度(血清P_i)的分析的图表结果。给予野生型单个剂量的蛋白(0.29mg kg体重^-1)，然而Fgf23敲除小鼠接受两个各自0.71mg kg体重^-1的剂量。数据表示为平均值±SEM；*,P<0.05和**,P<0.01，利用ANOVA。

图5A-5G显示关于FGF2至内分泌配体的转化的设计和结果。图5A为人FGF2、FGF19、FGF21、FGF23以及工程化FGF2-FGF19、FGF2-FGF21和FGF2-FGF23嵌合物的示意图。每一个配体和嵌合物的每一个组分的氨基酸边界用残基字母和编号来标记。已知配体晶体结构的β-三叶形核心结构域加以灰色阴影。嵌合物的FGF2部分中的突变的HS结合残基用残基字母和编号来标记。还标记的是在FGF23和FGF2-FGF23嵌合物中突变成谷氨酰胺的FGF23的C末端区域中的蛋白水解切割位点的精氨酸残基。图5B和5C显示举例说明FGF2^WT核心-FGF21^C-尾(图5B)和FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图5C)对肝素的结合的SPR传感图的叠加，和拟合饱和结合曲线。将肝素固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGF2^WT核心-FGF21^C-尾或FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾通过芯片上方。从饱和结合曲线推导出解离常数(K_Ds)。图5D和5E显示举例说明FGF2^WT核心-FGF23^C-尾(图5D)和FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图5E)对肝素的结合的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^WT核心-FGF23^C-尾或FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾通过含有固定肝素的芯片上方。图5F和5G显示在用指示的嵌合物或天然FGF刺激后HEK293细胞中Egr1表达的免疫印迹分析的结果。泳道上方的编号给出了以纳摩尔表示的添加的蛋白质的量。GAPDH蛋白表达用作上样对照。

图6是举例说明FGF1至内分泌配体的转化的示意图。显示了人FGF1、FGF19、FGF21、FGF23以及根据本发明的示意性FGF1-FGF19、FGF1-FGF21和FGF1-FGF23嵌合物的示意图。每一个配体和嵌合物的每一个组分的氨基酸边界用残基字母和编号来标记。已知配体晶体结构的β-三叶形核心结构域加以灰色阴影。嵌合物的FGF1部分中的突变的HS结合残基用残基字母和编号来标记。还标记的是在FGF23和FGF1-FGF23嵌合物中突变成谷氨酰胺的FGF23的C末端区域中的蛋白水解切割位点的精氨酸残基。

图7A-7G显示证明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾嵌合物显示FGF23-样活性的结果。图7A和7B显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图7A)或FGF23(图7B)对αKlotho-FGFR1c与固定在生物传感器芯片上的FGF23的结合的抑制的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23与固定浓度的αKlotho-FGFR1c复合物混合，随后将混合物通过FGF23芯片上方。图7C显示举例说明FGF2抑制αKlotho-FGFR1c对FGF23的结合失效的SPR传感图的叠加。以15:1的摩尔比混合FGF2与αKlotho-FGFR1c复合物，将混合物通过含固定FGF23的生物传感器芯片上方。图7D和7E显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾(图7D)或FGF23(图7E)对βKlotho-FGFR1c与FGF21的结合无抑制作用的SPR传感图的叠加。将FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾或FGF23与βKlotho-FGFR1c复合物以10:1的摩尔比混合，将混合物通过含固定FGF21的生物传感器芯片上方。图7F显示在FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾、FGF2^WT核心-FGF23^C-尾、FGF23或媒介物的腹膜内注射之前和注射之后8h小鼠中血清磷酸盐浓度(血清P_i)的分析。分别给予野生型小鼠和αKlotho敲除小鼠每kg体重0.21mg和0.51mg的蛋白。数据表示为平均值±SEM；**,P<0.01；***,P<0.001，利用ANOVA。图7G显示利用FGF2^ΔHBS核心-FGF23^C-尾、FGF2^WT核心-FGF23^C-尾、FGF23或媒介物注射的小鼠的肾组织中CYP27B1mRNA表达的定量分析。注射每kg体重0.21mg的蛋白。数据表示为平均值±SEM；***,P<0.001，利用ANOVA。

图8A-8G显示证明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物显示FGF21-样活性的结果。图8A-8B显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图8A)或FGF21(图8B)对βKlotho-FGFR1c与固定在生物传感器芯片上的FGF21的结合的抑制的SPR传感图的叠加。将递增浓度的FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21与固定浓度的βKlotho-FGFR1c复合物混合，随后将混合物通过FGF21芯片上方。图8C显示举例说明FGF2抑制βKlotho-FGFR1c对FGF21的结合失效的SPR传感图的叠加。以15:1的摩尔比混合FGF2与βKlotho-FGFR1c复合物，将混合物通过含固定FGF21的生物传感器芯片上方。图8D-8E显示举例说明FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾(图8D)或FGF21(图8E)对αKlotho-FGFR1c与FGF23的结合无抑制作用的SPR传感图的叠加。将FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21与αKlotho-FGFR1c复合物以10:1的摩尔比混合，将混合物通过含固定FGF23的生物传感器芯片上方。图8F显示在FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾或FGF21刺激的HEK293-βKlotho细胞中Egr1表达的免疫印迹分析的结果。泳道上方的数字给出了以ng ml^-1表示的添加的蛋白质的量。GAPDH蛋白表达表达用作上样对照。注意，FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物在诱导Egr1表达上比天然FGF21更有效力，这表明嵌合物具有激动性质。这是预料之中的，因为FGF2的核心结构域固有地具有比FGF21的核心结构域更大的对于FGFR的结合亲和力(参见图10A和10C)。图8G显示在腹膜内注射单独的胰岛素、胰岛素加FGF2^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物、胰岛素加FGF21或单独的媒介物之后和注射后指定的时间点上小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。注射每kg体重0.5个单位的胰岛素和每kg体重0.3mg FGF21配体。血糖浓度表达为注射前值的百分数。数据表示为平均值±SEM。

图9A-9C显示根据本发明的FGF1变体在ob/ob小鼠中的降糖作用。图9A显示在皮下注射FGF1或FGF21之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。图9B显示在皮下注射FGF1、FGF1^ΔNT或FGF1^ΔHBS之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。图9C显示在皮下注射FGF1或FGF1^ΔHBS核心-FGF21^C-尾嵌合物之前和注射之后指定的时间点上ob/ob小鼠的血糖浓度的分析的图表结果。对于图9A-9C中显示的实验，以0.5mg FGF蛋白/kg体重的推注方式注射ob/ob小鼠。数据表示为平均值±SD。

图10A-10F显示证明内分泌FGF相较于FGF2具有低的对于FGFR1c的结合亲和力的结果。图10A-10D显示举例说明FGFR1c对FGF2(图10A)、FGF19(图10B)、FGF21(图10C)和FGF23(图10D)的结合的SPR传感图的叠加和拟合饱和结合曲线。将递增浓度的FGFR1c配体-结合结构域通过含固定FGF2、FGF19、FGF21或FGF23的生物传感器芯片上方。图10E显示举例说明αKlotho-FGFR1c复合物对FGF23的结合的SPR传感图的叠加。将递增浓度的αKlotho-FGFR1c复合物通过含固定FGF23生物传感器芯片上方。图10F显示显示FGF23的C末端尾肽与FGFR1c之间的相互作用不存在的SPR传感图的叠加。将FGF2^3C-尾固定在生物传感器芯片上，将递增浓度的FGFR1c配体-结合结构域通过芯片上方。从饱和结合曲线推导出图10A-10E中给出的解离常数(_KDs)。

图11显示人FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)、FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)和FGF23(SEQ ID NO:351)(GenBank登录号AAG09917，将其通过引用全文并入本文)的C末端尾序列的比对。残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。FGF19与FGF21之间相同的残基加以灰色阴影。注意，40％的这些残基被定位至C端最末的序列。

图12显示人FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBan k登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)和具有单个对于F GF19是独特的残基的氨基酸置换或插入的FGF21的变体的C末端尾序列的比对。天然FGF21和FGF19的序列的残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。在天然FGF19的序列中，对于FGF19是独特的残基以粗体和加框表示，并且在FGF21C末端尾的变体的序列中，引入的FGF19残基以相同的方式突出显示。

图13显示人FGF21(SEQ ID NO:233)(GenBank登录号NP_061986，将其通过引用全文并入本文)、FGF19(SEQ ID NO:337)(GenBank登录号NP_005108，将其通过引用全文并入本文)和FGF21的变体的C末端尾序列的比对，在所述FGF21的变体中对于FGF19是独特的残基逐渐替代FGF21的对应残基或被插入FGF21序列。天然FGF21和FGF19的序列的残基数目在比对左边的括号中。空位(虚线)被引入来最优化比对。在天然FGF19的序列中，对于FGF19是独特的残基以粗体和加框表示，并且在FGF21C末端尾的变体的序列中，引入的FGF19残基以相同的方式来突出显示。

发明详述

本发明的一个方面涉及嵌合蛋白。嵌合蛋白包括偶连于C末端的N末端，其中N末端包括旁分泌成纤维细胞生长因子(“FGF”)的一部分并且C末端部分包括FGF21分子的C末端部分。旁分泌FGF的所述部分被修饰来相较于不具有所述修饰的部分，减小针对肝素和/或硫酸类肝素的结合亲和力。

如由Goetz等人(Goetz等人，“Molecular Insights into the Klotho-Dependent,Endocrine Mode of Action of Fibroblast Growth Factor19Subfamily Members,”Mol Cell Biol 3417-3428(2007)，将其通过引用全文并入本文)所描述的，哺乳动物成纤维细胞生长因子(FGF)家族包括18个多肽(FGF1至FGF10和FGF16至FGF23)，其参与胚胎发生过程中的许多生物过程，包括但不限于原肠胚形成、体制(bod y plan)形成、体节发生和基本上每一个组织/器官例如四肢、肺、脑和肾的形态发生(Bottcher等人，“Fibroblast Growth Factor Signaling During Early Vertebrate Development,”Endocr Rev 26:63-77(2005),和Thisse等人，“Functions and Regulations of Fibroblast Growth Fac tor Signaling During Embryonic Development,”Dev Biol 287:390-402(2005)，将其通过引用全文并入本文)。

FGF通过结合于FGFR酪氨酸激酶，使其二聚化并激活其执行它们的生物学作用，所述FGFR酪氨酸激酶由4个不同的基因(Fgfr1至Fgfr4)来编码。典型的FGFR由细胞外结构域(由3个免疫球蛋白样结构域组成)、单次跨膜结构域和负责酪氨酸激酶活性的细胞内结构域组成(Mohammadi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)，将其通过引用全文并入本文)。

主要FGFR的数目因FGFR1至FGFR3的免疫球蛋白样结构域3的第二半中的主要组织特异性选择性剪接事件而从4个增加至7个，这产生了上皮谱系特异性“b”和间充质谱系特异性“c”同种型(Moham madi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)和Ornitz等人，“Fibroblast Growth Factors,”Genome Biol 2(3):reviews3005.1-r eviews3005.12(2001)，将其通过引用全文并入本文)。一般而言，FGF的受体-结合特异性沿着受体的该主要选择性剪接分开，则此FGFRb-相互作用FGF由上皮细胞产生，而FGFRc-相互作用FGF由间充质细胞产生(Ornitz等人，“Fibroblast Growth Factors,”Genome Biol 2(3):reviews3005.1-reviews3005.12(2001)，将其通过引用全文并入本文)。FGF和FGFR的这些相互表达模式导致上皮与间充质之间的特异性旁分泌FGF信号转导环建立，这对于胚胎发育过程中正确的器官发生和图式发育以及成体生物体中的组织动态平衡是必需的。

基于序列同源性以及系统发育和结构考虑，将18种哺乳动物FGF分类成6个亚家族(Itoh等人，“Fibroblast growth factors:from molecular evolution to roles in development,metabolism,and disease,”J Biochem 149:121-130(2011)；Mohammadi等人，“Structural basis for fibroblast growth factor receptor activation,”Cytokine Growth Factor Rev 16:107-137(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)。FGF核心同源性结构域(约120个氨基酸长)侧翼连接有在长度和一级序列上，特别地在不同的FGF亚家族间是高度可变的N末端和C末端序列。FGF19的核心区域与FGF21(38％)和FGF23(36％)共有最高序列同一性，从而这些配体被认为形成一个亚家族。

基于作用模式，18种哺乳动物FGF被分类成旁分泌作用配体(5个FGF亚家族)和包含FGF19、FGF21和FGF23的内分泌作用配体(1个FGF亚家族)(Itoh和Ornitz,“Fibroblast Growth Factors:From Molecular Evolution to Roles in Development,Metabolism and Disease,”J.Biochem.149:121-130(2011)；Mohammadi等人，“Structural Basis for Fibroblast Growth Factor Receptor Activation,”Cytokine Growth Factor Rev.16:107-137(2005)，将所述文献通过引用全文并入本文)。

嵌合成纤维细胞生长因子21蛋白及其使用方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。