专利摘要

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，提供了一种马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途。本发明首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因，并确定其核苷酸序列(SEQIDNO.1)以及氨基酸序列(SEQIDNO.2)，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。此外，发明人通过将马尾松长叶烯合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到马尾松长叶烯合成酶，在体外酶活实验中该酶可将法基尼焦磷酸催化合成长叶烯和α‑蒎烯，对植食性病虫害防御具有重要意义。

权利要求

1.一种马尾松长叶烯合成酶基因，其特征在于，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，其特征在于，所述扩增引物对如下：

正向引物为SEQ ID NO.3：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’；

反向引物为SEQ ID NO.4：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’。

3.一种马尾松长叶烯合成酶，其特征在于，马尾松长叶烯合成酶氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.权利要求3所述的马尾松长叶烯合成酶在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。

5.一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，其特征在于，利用权利要求3所述的马尾松长叶烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到长叶烯和/或α-蒎烯。

6.一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体包括马尾松长叶烯合成酶基因和载体；

马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述载体包括表达载体或克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，表达载体包括pET-28a。

9.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，克隆载体包括pClone007。

10.一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括马尾松长叶烯合成酶基因和宿主细胞，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

11.根据权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。

12.权利要求6-9任一项所述的重组载体或权利要求10或11所述的工程菌在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，涉及一种马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途。

背景技术

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)速生、耐干旱瘠薄、适应性强，是我国南方荒山造林的先锋树种，在一些地理条件较差的山地，马尾松甚至是唯一可造林的本土树种。马尾松广泛分布在我国亚热带17个省(区、市)，根据第八次全国森林资源清查结果(2016年)，马尾松林面积约为1001万公顷，而且马尾松年产松脂总量为60-80万吨，约占我国松脂总量的70％。因此，马尾松在我国速生丰产材用和脂用林基地建设中占据极其重要的地位。

马尾松松脂成分主要为一些萜类物质，单萜，倍半萜以及二萜等。萜烯类化合物为马尾松主要次生代谢物质，植食性昆虫诱导的植物挥发物的重要成分，是病原入侵后的第一道防线。然而，目前关于马尾松中萜烯类合成酶的生物合成基因还未被分离和鉴定。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种马尾松长叶烯合成酶基因，以填补现有技术对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白。

本发明第二目的在于提供马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，可以快速、准确得到马尾松长叶烯合成酶基因。

本发明的第三目的在于提供马尾松长叶烯合成酶及其在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用，填补现有技术中缺少马尾松长叶烯合成酶的空白，同时提供该合成酶的工业应用。

本发明的第四目的在于提供一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，填补现有技术中缺少可以利用生物技术工业化生产长叶烯和/或α-蒎烯方法的空白。

本发明的第五目的在于提供含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体和工程菌及其应用，为马尾松长叶烯合成酶的获取和利用提供更简便的生物模块。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种马尾松长叶烯合成酶基因，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，所述扩增引物对如下：

正向引物为：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’(SEQ ID NO.4)。

一种马尾松长叶烯合成酶，马尾松长叶烯合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

马尾松长叶烯合成酶在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。

一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，利用上述马尾松长叶烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到长叶烯和/或α-蒎烯。

一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，所述重组载体包括马尾松长叶烯合成酶基因和载体；

马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述载体包括表达载体或克隆载体；

优选地，表达载体包括pET-28a；

优选地，克隆载体包括pClone007。

一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的工程菌，所述工程菌包括马尾松长叶烯合成酶基因和宿主细胞，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。

含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，或，工程菌，在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。此外，发明人通过将马尾松长叶烯合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到马尾松长叶烯合成酶，在体外酶活实验中该酶可将法基尼焦磷酸催化合成长叶烯和α-蒎烯，对植食性病虫害防御具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中的马尾松长叶烯合成酶基因的PCR片段；

图2为实施例3中的SDS-PAGE分析马尾松长叶烯合成酶上清纯化结果，其中，泳道1：marker(kDd)；泳道2：诱导前；泳道3：诱导后；泳道4：P破菌沉淀；泳道5：Pre上柱流出液；泳道6：Aft流出蛋白；泳道7：5％洗杂蛋白；泳道8：30％洗脱蛋白；泳道9：100％洗脱蛋白；

图3为实施例3中的western-blot检测马尾松长叶烯合成酶纯化结果；

图4为实施例4中的GC-MS检测α-蒎烯图谱；

图5为实施例4中的α-蒎烯的离子特征峰与谱库比对结果；

图6为实施例4中的GC-MS检测长叶烯图谱；

图7为实施例4中的长叶烯离子特征峰与谱库对比结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

马尾松长叶烯合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明首次从马尾松中克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因(在本发明中又可称为“66887”)，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对马尾松中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为马尾松的相关研究提供了理论和基础支持。

马尾松长叶烯合成酶基因的核苷酸序列如下：

ATGGCTCAAATTTCTATAGGTGCACCACTATCTGCCGAGGTGAACGGATCCTGCATCAACACTCATCATCATGGAAATCTGTGGGACGACTATTTCATACAATCTCTTAAGTCGCCTTATGAGGCACCTGAATGTCATGAACGCTGTGAAAAGATGATTGAAGAAGTGAAGCATTTACTTTTGAGTGAGATGAGAGATGGCAACGATGATTTAATCAAACGTCTCCAGATGGTTGACATTTTTGAATGTCTAGGAATTGATCGGCACTTTCACCATGAAATACAAGCTGCTCTTGATTACGTGTACAGATATTGGAACGAGCTGGAAGGCATCGGTGTTGGAACAAGAGATTCCCTCACCAAAGATCTCAATGCTACGGGTTTGGGATTTCGGGCTCTCCGACTCCATCGATATAACGTATCCTCAGCTGTCTTGGAGAATTTCAAGAACGAAAATGGGCTGTTCTTCCACAGTTCCACGGTTCAAGAAGAAGAAGTGAGATGCATGTTGACGTTACTTAGGGCTTCAGAAATTTCATTTCCCGGAGAAAAGGTGATGGACGAGGCAAAGGCATTCGCAACAGAATATCTAAACCAACTTTTGACGAGAGTGGATATAAGGGAAGTGGGTGAAAGCCTTTTAAGAGAGGTTAGGTATGCCCTAGATTTTCCTTGGTACTGCAGTGTGCCGAGATGGGAGGCTAGGAGCTTCATCGAAATATTTGGACAAAGCAATTCATGGCTTAACTCAACTATGAACAAAAAAGTTTTAGAGTTGGCTAAATTGGACTTCAATATTCTGCAATCCGCACATCAAAGAGAGCTACAGCTTCTCTCAAGGTGGTGGTCACAATCGGATATAGAGAAGCAGAATTTCTACCGGAAGCGTCACGTGGAATTTTACTTTTGGATGGTTATAGGCACGTTCGAACCGGAGTTTTCGAGCAGCAGAATTGCATTCGCAAAAATTGCGACACTGATGACTGTCCTAGATGATCTCTATGATACTCACGGAACGTTGGAACAACTAAAAATCTTCACAGAAGCAGTCAAACGATGGGATCTTTCATTACAAGACCGTCTTCCAGACTACATAAAGATTACTCTGGAATTCTTCTTCAACACATCCAATGAATTGAATGCTGAAGTTGCTAAAATGCAAGAACGGGATATGTCAGCCTACATACGAAAAGCAGGCTGGGAACGATACCTTGAAGGGTATATGCAAGAGTCCGAATGGATGGCGGCTCGACATGTCCCTACCTTTGACGATTACATGAAGAATGGCAAACCCAGCTCTGGAATGTGTATACTAAATTTGTATTCGCTTCTGTTAATGGGGCAACTTGTACCTGACAACATTCTGGAGCAAATACACCTTCCATCCAAGATCCATGAACTTGTGGAATTGACGGCCAGACTGGTCGACGACTCAAAGGATTTCCAGGCGAAGAAGGATGGTGGGGAGTTTGCTTCAGGTATAGAGTGCTACTTGAAAGAGAAGCCTGAATGTACAGAGGAAGATGCAATGAATCATCTCATTGGGCTCCTCAATCTGACAGCGATGGAATTAAATTGGGAATTTGTAAAACATGACGGTGTGGCGCTGTGTCTCAAGAAGTTCGTCTTCGAAGTTGCACGAGGTCTCCGATTCATCTACAAATACAGAGACGGCTTTGACTATTCCAACGAGGAGATGAAGAGCCAGATAACCAAAATCCTTATCGATCAAGTGCCCATCTGA(SEQ ID NO.1)。

马尾松长叶烯合成酶基因的扩增引物对，扩增引物对如下：

正向引物为：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明提供的扩增引物对可以快速准确地从马尾松基因组中扩增得到马尾松长叶烯合成酶基因，特异性好，效率高。

马尾松长叶烯合成酶的氨基酸序列如下：

MAQISIGAPLSAEVNGSCINTHHHGNLWDDYFIQSLKSPYEAPECHERCEKMIEEVKHLLLSEMRDGNDDLMKRLQMVDIFECLGIDRHFHHEIQAALDYVYRYWNELEGIGVGTRDSLTKDLNATGLGFRALRLHRYNVSSAVLENFKNENGLFFHSSTVQEEEVRCRLTLLRASEISFPGEKVMDEAKAFATEYLNQLLTRVDIREVGESLLREVRYALDFPWYCSVPRWEARSFIEIFGQSYSWLNSTMNKKVLELAKLDFNILQSAHQRELQLLSRWWSQSDIEKQNFYRKRHVEFYFWMVIGTFEPEISSSRIAFAKIATLMTVLDDLYDTHGTLEQLKIFTEAVKRWDLSLQDRLPDYIKITLEFFFNTSNELNAEVAKMQERDMSAYIRKAGWERYLEGYMQESEWMAARHVPTFDDYMKNGKPSSGMCILNLYSLLLMGQLVPDNILEQIHLPSKIHELVELTARLVDDSKDFQAKKDGGEFASGIECYLKEKPECTEEDAMNHLIGLLNLTAMELNWEFVKHDGVALCLKKFVFEVARGLRFIYKYRDGFDYSNEEMKSQITKILIDQVPI(SEQ ID NO.2)。

马尾松长叶烯合成酶在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。本发明中马尾松长叶烯合成酶可以以法尼基焦磷酸为底物，催化合成长叶烯和α-蒎烯，长叶烯和α-蒎烯中的任意一种都对植食性病虫害防御具有重要意义。可以理解的是，无论目标产物是长叶烯、α-蒎烯、还是长叶烯和α-蒎烯，都可以利用马尾松长叶烯合成酶可以以法尼基焦磷酸为底物制备得到。

一种长叶烯和/或α-蒎烯的生产方法，利用本发明的马尾松长叶烯合成酶催化法尼基焦磷酸，得到长叶烯和/或α-蒎烯。

在优选地实施方式中，具体的，该生产方法中各原料的用量比例可以参照如下进行：HEPES，25Mm；KCl，100mM；MgCl2，10mM；10％(v/v)甘油；DTT，5mM；FPP，30mM；加入30ng纯化后的马尾松长叶烯合成酶置于30℃反应1h。

一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的重组载体，包括马尾松长叶烯合成酶基因和载体，其中，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的重组载体可以包括表达载体或克隆载体，将马尾松长叶烯合成酶基因重组于表达载体或克隆载体中，构建生物模块，可以实现马尾松长叶烯合成酶基因的简便快速利用，快速大量得到目标基因或目标蛋白。在本发明中，表达载体优选为pET-28a；克隆载体优选为pClone007。

一种含有马尾松长叶烯合成酶基因的工程菌，工程菌包括马尾松长叶烯合成酶基因和宿主细胞，马尾松长叶烯合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将马尾松长叶烯合成酶基因设置于宿主细胞中，可以快速大量得到目标基因和目标蛋白酶，工程菌构成的生物模块避免了目标基因使用时需要从马尾松基因组中PCR扩增的繁琐操作。宿主细胞优选为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。

本发明提供一种马尾松长叶烯合成酶的生产方法，培养本发明提供的工程菌，获得培养物，再从培养物中分离得到马尾松长叶烯合成酶。

上述重组载体或工程菌在生产长叶烯和/或α-蒎烯中的应用。本发明提供的重组载体和工程菌可以直接进行培养、扩增和表达得到马尾松长叶烯合成酶，得到的大量活性马尾松长叶烯合成酶可以用于生产长叶烯和/或α-蒎烯。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1

克隆马尾松长叶烯合成酶基因，构建克隆载体及转化原核细胞。

提取马尾松茎部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成cDNA。以该cDNA为模板，扩增引物如下：

正向引物为：5’-CAAGATTGGATTCGGTGAAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-GCGGAGATATCCGATCTTGA-3’(SEQ ID NO.4)；

利用Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，进行PCR扩增。

PCR条件为：95℃，3min；95℃，15sec；56℃，15sec；72℃，2min；35个循环；72℃延伸5min。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，图1的M为DNAmarker DL2000，目标基因马尾松长叶烯合成酶基因的片段大小约为1743bp，符合预期。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目标基因片段，将目标片段进行TA克隆，连接到pClone007载体上，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中。

转化条件为：在50μl感受态细胞中加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水域热激45s，迅速冰浴，静置2min，加入500μl不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，将菌液3000rpm离心1min，弃400μl上清液，悬浮菌液，涂布于含有抗生素(Amp)的固体LB平板，37℃倒置培养12-16h。

采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5ml离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取lμl用作模板进行PCR检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。

经测序，成功克隆得到马尾松长叶烯合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有1743个碱基，共编码580个氨基酸。同时得到将马尾松长叶烯合成酶基因插入到pClone007克隆载体的重组载体以及将重组载体成功转化至原核细胞大肠杆菌DH5α中的阳性工程菌。

实施例2

长叶烯合成酶基因构建表达载体及转化原核细胞。

将实施例1中克隆好的目标片段通过同源重组的方式转化到pET28a线性化载体上。

连接反应条件为：将反应体系混合后置于37℃孵育30min，然后于20℃1h，将5μl反应液加到50μl的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀冰浴静置30min，轻轻取出，42℃，热激60s，立即冰浴2min，加入500μlLB培养基37℃培养1h；去100μl菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，过夜培养。

挑取抗生素(Kan)筛选得到的阳性菌落，提取质粒。将原核表达载体转入到大肠杆菌BL21菌株中，37℃，200rpm，待培养至OD600为0.6，向试管培养液中加入终浓度0.lmMIPTG，之后分别置于15℃和37℃诱导表达,得到大量表达马尾松长叶烯合成酶的菌液。

实施例3

马尾松长叶烯合成酶的原核表达、蛋白纯化、蛋白质检。

挑选实施例2中含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种。

挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃震荡培养至OD₆₀₀约0.6，取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，37℃震荡培养3h；分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL 1×loading buffer重悬裂解，SDS-PAGE检测。结果如图2所示，其中，泳道1：marker(kDd)；泳道2：诱导前；泳道3：诱导后；泳道4：P破菌沉淀；泳道5：Pre上柱流出液；泳道6：Aft流出蛋白；泳道7：5％洗杂蛋白；泳道8：30％洗脱蛋白；泳道9：100％洗脱蛋白。

取保存于-20℃的菌种100μL接种于100mL LB液体培养基(氨苄抗性)中震荡培养过夜；取100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD600约0.6，降低培养温度到30℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，30℃继续震荡培养3h；8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min。

超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、99个循环；16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀至于4℃备用。

上清蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤备用；准备Ni-NTA柱；以1ml/min的流速上样上清蛋白溶液；以NTA-0缓冲液(pH8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；分别以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱；对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，对马尾松长叶烯合成酶进行Western检测。结果如图3所示，目标蛋白65kDd，标签15kd，融合蛋白约80kd。

实施例4

马尾松长叶烯合成酶的生化功能

以法尼基焦磷酸(FPP)为底物，酶促反应体系为：HEPES，25Mm；KCl，100mM；MgCl₂，10mM；10％(v/v)甘油；DTT，5mM；FPP，30mM；加入30ng纯化后的蛋白置于30℃1h。

反应结束后，采用固相微萃取SPME纤维PDMS 100μm顶空萃取挥发物质30min，40℃，30min进样。采用GC-MS联用(Ag11entGC-MS789OB-5977A)对催化产物进行检测。

检测方法

GC-MS条件：色谱柱：DB-5MS(60m×0.25mm ID×0.25μm膜厚)。程序升温参数：初始温度50℃，保持2min，以3℃/min升温至80℃保持2min，以5℃/min升温至180℃保持1min，以10℃/min升温至230℃保持5min,最后以20℃/min升温至250℃保持3min。进样口温度：220℃。脉冲不分流，进样1μL，载气为高纯氦气(99.999％)，柱流速：1.5mL/min。色谱-质谱接口温度：250℃。离子源温度：230℃。离子化方式：EI。电子能量：70eV。扫描质量范围50-500m/z。

定性：各组分分别用NIST08标准谱库进行检索匹配，碎片比对，并结合相关文献报道、各成分的相对保留时间等进行定性。

α-蒎烯检测结果如图4所示，α-蒎烯的出峰时间为14.738min。

图5为马尾松α-蒎烯离子特征峰检测结果；α-蒎烯离子特征峰NIST08标准谱库对比结果。

长叶烯检测结果如图6所示，长叶烯出峰时间为32.685min。

图7为马尾松长叶烯离子特征峰检测结果；长叶烯离子特征峰NIST08标准谱库对比结果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1743

<212> DNA

<213> 马尾松

<400> 1

atggctcaaa tttctatagg tgcaccacta tctgccgagg tgaacggatc ctgcatcaac 60

actcatcatc atggaaatct gtgggacgac tatttcatac aatctcttaa gtcgccttat 120

gaggcacctg aatgtcatga acgctgtgaa aagatgattg aagaagtgaa gcatttactt 180

ttgagtgaga tgagagatgg caacgatgat ttaatcaaac gtctccagat ggttgacatt 240

tttgaatgtc taggaattga tcggcacttt caccatgaaa tacaagctgc tcttgattac 300

gtgtacagat attggaacga gctggaaggc atcggtgttg gaacaagaga ttccctcacc 360

aaagatctca atgctacggg tttgggattt cgggctctcc gactccatcg atataacgta 420

tcctcagctg tcttggagaa tttcaagaac gaaaatgggc tgttcttcca cagttccacg 480

gttcaagaag aagaagtgag atgcatgttg acgttactta gggcttcaga aatttcattt 540

cccggagaaa aggtgatgga cgaggcaaag gcattcgcaa cagaatatct aaaccaactt 600

ttgacgagag tggatataag ggaagtgggt gaaagccttt taagagaggt taggtatgcc 660

ctagattttc cttggtactg cagtgtgccg agatgggagg ctaggagctt catcgaaata 720

tttggacaaa gcaattcatg gcttaactca actatgaaca aaaaagtttt agagttggct 780

aaattggact tcaatattct gcaatccgca catcaaagag agctacagct tctctcaagg 840

tggtggtcac aatcggatat agagaagcag aatttctacc ggaagcgtca cgtggaattt 900

tacttttgga tggttatagg cacgttcgaa ccggagtttt cgagcagcag aattgcattc 960

gcaaaaattg cgacactgat gactgtccta gatgatctct atgatactca cggaacgttg 1020

gaacaactaa aaatcttcac agaagcagtc aaacgatggg atctttcatt acaagaccgt 1080

cttccagact acataaagat tactctggaa ttcttcttca acacatccaa tgaattgaat 1140

gctgaagttg ctaaaatgca agaacgggat atgtcagcct acatacgaaa agcaggctgg 1200

gaacgatacc ttgaagggta tatgcaagag tccgaatgga tggcggctcg acatgtccct 1260

acctttgacg attacatgaa gaatggcaaa cccagctctg gaatgtgtat actaaatttg 1320

tattcgcttc tgttaatggg gcaacttgta cctgacaaca ttctggagca aatacacctt 1380

ccatccaaga tccatgaact tgtggaattg acggccagac tggtcgacga ctcaaaggat 1440

ttccaggcga agaaggatgg tggggagttt gcttcaggta tagagtgcta cttgaaagag 1500

aagcctgaat gtacagagga agatgcaatg aatcatctca ttgggctcct caatctgaca 1560

gcgatggaat taaattggga atttgtaaaa catgacggtg tggcgctgtg tctcaagaag 1620

ttcgtcttcg aagttgcacg aggtctccga ttcatctaca aatacagaga cggctttgac 1680

tattccaacg aggagatgaa gagccagata accaaaatcc ttatcgatca agtgcccatc 1740

tga 1743

<210> 2

<211> 580

<212> PRT

<213> 马尾松

<400> 2

Met Ala Gln Ile Ser Ile Gly Ala Pro Leu Ser Ala Glu Val Asn Gly

1 5 10 15

Ser Cys Ile Asn Thr His His His Gly Asn Leu Trp Asp Asp Tyr Phe

20 25 30

Ile Gln Ser Leu Lys Ser Pro Tyr Glu Ala Pro Glu Cys His Glu Arg

35 40 45

Cys Glu Lys Met Ile Glu Glu Val Lys His Leu Leu Leu Ser Glu Met

50 55 60

Arg Asp Gly Asn Asp Asp Leu Met Lys Arg Leu Gln Met Val Asp Ile

65 70 75 80

Phe Glu Cys Leu Gly Ile Asp Arg His Phe His His Glu Ile Gln Ala

85 90 95

Ala Leu Asp Tyr Val Tyr Arg Tyr Trp Asn Glu Leu Glu Gly Ile Gly

100 105 110

Val Gly Thr Arg Asp Ser Leu Thr Lys Asp Leu Asn Ala Thr Gly Leu

115 120 125

Gly Phe Arg Ala Leu Arg Leu His Arg Tyr Asn Val Ser Ser Ala Val

130 135 140

Leu Glu Asn Phe Lys Asn Glu Asn Gly Leu Phe Phe His Ser Ser Thr

145 150 155 160

Val Gln Glu Glu Glu Val Arg Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Ala Ser

165 170 175

Glu Ile Ser Phe Pro Gly Glu Lys Val Met Asp Glu Ala Lys Ala Phe

180 185 190

Ala Thr Glu Tyr Leu Asn Gln Leu Leu Thr Arg Val Asp Ile Arg Glu

195 200 205

Val Gly Glu Ser Leu Leu Arg Glu Val Arg Tyr Ala Leu Asp Phe Pro

210 215 220

Trp Tyr Cys Ser Val Pro Arg Trp Glu Ala Arg Ser Phe Ile Glu Ile

225 230 235 240

Phe Gly Gln Ser Tyr Ser Trp Leu Asn Ser Thr Met Asn Lys Lys Val

245 250 255

Leu Glu Leu Ala Lys Leu Asp Phe Asn Ile Leu Gln Ser Ala His Gln

260 265 270

Arg Glu Leu Gln Leu Leu Ser Arg Trp Trp Ser Gln Ser Asp Ile Glu

275 280 285

Lys Gln Asn Phe Tyr Arg Lys Arg His Val Glu Phe Tyr Phe Trp Met

290 295 300

Val Ile Gly Thr Phe Glu Pro Glu Ile Ser Ser Ser Arg Ile Ala Phe

305 310 315 320

Ala Lys Ile Ala Thr Leu Met Thr Val Leu Asp Asp Leu Tyr Asp Thr

325 330 335

His Gly Thr Leu Glu Gln Leu Lys Ile Phe Thr Glu Ala Val Lys Arg

340 345 350

Trp Asp Leu Ser Leu Gln Asp Arg Leu Pro Asp Tyr Ile Lys Ile Thr

355 360 365

Leu Glu Phe Phe Phe Asn Thr Ser Asn Glu Leu Asn Ala Glu Val Ala

370 375 380

Lys Met Gln Glu Arg Asp Met Ser Ala Tyr Ile Arg Lys Ala Gly Trp

385 390 395 400

Glu Arg Tyr Leu Glu Gly Tyr Met Gln Glu Ser Glu Trp Met Ala Ala

405 410 415

Arg His Val Pro Thr Phe Asp Asp Tyr Met Lys Asn Gly Lys Pro Ser

420 425 430

Ser Gly Met Cys Ile Leu Asn Leu Tyr Ser Leu Leu Leu Met Gly Gln

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Leu Val Pro Asp Asn Ile Leu Glu Gln Ile His Leu Pro Ser Lys Ile

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His Glu Leu Val Glu Leu Thr Ala Arg Leu Val Asp Asp Ser Lys Asp

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Phe Gln Ala Lys Lys Asp Gly Gly Glu Phe Ala Ser Gly Ile Glu Cys

485 490 495

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Leu Ile Gly Leu Leu Asn Leu Thr Ala Met Glu Leu Asn Trp Glu Phe

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Val Lys His Asp Gly Val Ala Leu Cys Leu Lys Lys Phe Val Phe Glu

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Val Ala Arg Gly Leu Arg Phe Ile Tyr Lys Tyr Arg Asp Gly Phe Asp

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Tyr Ser Asn Glu Glu Met Lys Ser Gln Ile Thr Lys Ile Leu Ile Asp

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 4

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马尾松长叶烯合成酶基因和产品及用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。