专利摘要

本发明涉及一种胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。该胺脱氢酶突变体，由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到。上述胺脱氢酶的催化效率较高。

权利要求

1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到；

所述野生型胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的胺脱氢酶突变体，其特征在于，所述野生型胺脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的胺脱氢酶突变体。

4.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的胺脱氢酶突变体的编码序列。

5.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求1～2任一项所述的胺脱氢酶突变体的编码序列。

6.权利要求5所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增，酶切后连接到空载体中，得到胺脱氢酶突变库质粒；

将所述胺脱氢酶突变库质粒分别转化到宿主细胞中，得到转化细胞；

采用IVC-FACS方法对转化细胞进行高通量筛选，得到所述重组细胞。

7.根据权利要求6所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。

8.根据权利要求6所述的重组细胞的制备方法，其特征在于，所述对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的引物对PCR扩增所述野生型胺脱氢酶的编码序列。

9.权利要求1～2任一项所述的胺脱氢酶突变体、权利要求3所述的酶制剂、权利要求4所述的重组载体或者权利要求5所述的重组细胞在制备手性胺中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用。

背景技术

手性胺在有机合成、香料、医药等方面有广泛的应用，是重要的中间体。手性胺的不同对映异构体的立体结构的差异，使得不同的手性对映体的活性不同，作用于生命体时表现出的生理活性和毒害作用也不同。因此，手性胺逐步成为用于评价药物安全性和药效的重要指标。

目前，制备手性胺的方法主要为化学催化剂和生物酶催化法，相比于化学催化剂，酶催化法具有更佳的催化效果，尤其是在识别手性胺的两种对映体方面，生物酶制剂催化手性药物选择性合成具有显著的技术优势。其中，胺脱氢酶(amine dehydrogenase，AmDH)能够催化前手性酮合成手性胺，是一种有效的、制备手性胺的生物催化剂。然而，现有的胺脱氢酶的催化效率较低，不能满足实际应用的需要。

发明内容

基于此，有必要提供一种催化效率较高的胺脱氢酶。

此外，还提供一种胺脱氢酶突变体的应用、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法。

一种胺脱氢酶突变体，由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到；

或者，由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到。

本研究对胺脱氢酶进行了大量的研究，研究结果发现，将野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸，得到的胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率。经试验验证，上述胺脱氢酶突变体的Kcat值为468.34s-1～501.22s-1，说明上述胺脱氢酶突变体具有较高的催化速率，催化效率较高。

其中一个实施例中，所述野生型胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

其中一个实施例中，所述野生型胺脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

一种酶制剂，包括上述胺脱氢酶突变体。

一种重组载体，包括上述胺脱氢酶突变体的编码序列。

一种重组细胞，包括上述胺脱氢酶突变体的编码序列。

上述重组工程菌细胞的制备方法，包括如下步骤：

对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增，酶切后连接到空载体中，得到胺脱氢酶突变库质粒；

将所述胺脱氢酶突变库质粒分别转化到宿主细胞中，得到转化细胞；及

采用IVC-FACS方法对转化细胞进行高通量筛选，得到所述重组细胞。

其中一个实施例中，所述对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。

其中一个实施例中，所述对所述野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的引物对PCR扩增所述野生型胺脱氢酶的编码序列。

上述胺脱氢酶突变体、上述酶制剂、上述重组载体或者上述重组细胞在制备手性胺中的应用。

附图说明

图1为野生型胺脱氢酶的蛋白晶体模型的结构示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。未特别说明，序列表中的碱基序列均为从5’端到3’端的顺序。

实施方式的胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率，能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺，以能够用于制备手性胺。具体地，该胺脱氢酶突变体，由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到；或者，由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到。

本研究对胺脱氢酶进行了大量的研究，发现将野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸，或者，将野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸，得到的胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率。

其中，野生型胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。具体地，如SEQ ID No.1所示的序列为：MEKIRVIIWGLGAMGGGMARMILQKKGMEIVGAIASRPEKSGKDLGEVLDLGLKTGVTISCDPETVLKQPADIVLLATSSFTREVYPQLQRIIASGKNVITIAEEMAYPAYREPELAAKIDKMAKDHGVTVLGTGINPGFVLDTLIIALSGVCMDIKKITARRINDLSPFGTTVMRTQGVGTTVDEFRKGLEEGTIVGHIGFPESISLISEALGLEIDEIREMREPIVSNVYRETPYARVEPGMVAGCKHTGIGYRKGEPVIVLEHPQQIRPELEDVETGDYIEIEGTPNIKLSIKPEIPGGIGTIAIAVNMIPKVISANTGLVTMKDLPVPAALMGDIRKLAKDGVNNA。

进一步地，野生型胺脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。具体地，如SEQ IDNo.2所示的序列为：ATGGAAAAAATCCGTGTTATCATCTGGGGTCTGGGTGCTATGGGTGGTGGTATGGCTCGTATGATCCTGCAGAAAAAAGGTATGGAAATCGTTGGTGCTATCGCTTCTCGTCCGGAAAAATCTGGTAAAGACCTGGGTGAAGTTCTGGACCTGGGTCTGAAAACCGGTGTTACCATCTCTTGCGACCCGGAAACCGTTCTGAAACAGCCGGCTGACATCGTTCTGCTGGCTACCTCTTCTTTCACCCGTGAAGTTTACCCGCAGCTGCAGCGTATCATCGCTTCTGGTAAAAACGTTATCACCATCGCTGAAGAAATGGCTTACCCGGCTTACCGTGAACCGGAACTGGCTGCTAAAATCGACAAAATGGCTAAAGACCACGGTGTTACCGTTCTGGGTACCGGTATCAACCCGGGTTTCGTTCTGGACACCCTGATCATCGCTCTGTCTGGTGTTTGCATGGACATCAAAAAAATCACCGCTCGTCGTATCAACGACCTGTCTCCGTTCGGTACCACCGTTATGCGTACCCAGGGTGTTGGTACCACCGTTGACGAATTCCGTAAAGGTCTGGAAGAAGGTACCATCGTTGGTCACATCGGTTTCCCGGAATCTATCTCTCTGATCTCTGAAGCTCTGGGTCTGGAAATCGACGAAATCCGTGAAATGCGTGAACCGATCGTTTCTAACGTTTACCGTGAAACCCCGTACGCTCGTGTTGAACCGGGTATGGTTGCTGGTTGCAAACACACCGGTATCGGTTACCGTAAAGGTGAACCGGTTATCGTTCTGGAACACCCGCAGCAGATCCGTCCGGAACTGGAAGACGTTGAAACCGGTGACTACATCGAAATCGAAGGTACCCCGAACATCAAACTGTCTATCAAACCGGAAATCCCGGGTGGTATCGGTACCATCGCTATCGCTGTTAACATGATCCCGAAAGTTATCTCTGCTAACACCGGTCTGGTTACCATGAAAGACCTGCCGGTTCCGGCTGCTCTGATGGGTGACATCCGTAAACTGGCTAAAGACGGTGTTAACAACGCT。

需要说明的是，由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来决定，故同一氨基酸可对应不同的编码序列。因此本申请中的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，除可由如SEQ IDNo.2所示的编码序列所编码，也可由如SEQ ID No.2所示编码序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的编码序列所编码得到。本领域技术人员可以根据本申请公开的如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其他适合的方法获得本申请的野生型氨胺脱氢酶的核苷酸序列，因此，编码上述野生型氨胺脱氢酶的核苷酸序列的编码序列并不仅限于SEQ ID NO.2所示的编码序列。如果编码得到的蛋白与本申请的野生型氨胺脱氢酶的核苷酸序列没有明显的功能差异，也包括在本发明的范围内。

此外，由于蛋白编码序列的多态性及变异，天然存在的蛋白质会出现基因突变，编码序列中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。因此，存在着一些生理和生物活性上基本等同于无变异蛋白质的蛋白。这些结构不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。

功能等同的变异体同样适用于通过缺失、插入和突变等人工手段改变一个或多个密码子，从而向一种蛋白质的氨基酸序列中导入这类变异而制成的多肽。尽管这样能获得更多不同形式的变异体，但所得的变异体作为功能等同变异体的前提是其生理活性基本等同于原始无变异蛋白质的活性。

一般的，功能等同变异体的编码序列是同源的，因此，由至少一种改变(如蛋白质的编码序列中一个或多个碱基的缺失、插入或取代或者蛋白质的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸缺失、插入或取代)所得的多肽或蛋白一般具有功能上等同于所述蛋白质的活性，因此，由上述编码序列编码的到的多肽或上述氨基酸序列组成的多肽，如果编码得到的蛋白本申请的野生型氨胺脱氢酶的基酸序列没有明显的功能差异，也包括在本申请的范围内。

在其中一个实施例中，胺脱氢酶突变体的作用底物包括前手性酮和游离氨。

其中，前手性酮为4酮基戊酸前手性酮。游离氨为氨气游离氨。辅酶为还原型辅酶Ⅰ(NADH)辅酶。

上述胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率。经试验验证，上述胺脱氢酶突变体的Kcat值为468.34s-1～501.22s-1，说明上述胺脱氢酶突变体具有较高的催化速率，催化效率较高。

研究发现，野生型胺脱氢酶对底物的亲和性较高，但是由于野生型胺脱氢酶主要在体内比较温和的环境中发挥作用，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此，野生型胺脱氢酶在应用中往往遇到催化效率低等问题。而上述胺脱氢酶突变体的KM值为17.12μM～23.21μM，与野生型胺脱氢酶的KM值相当，说明上述胺脱氢酶突变体对底物仍保持较高的亲和力。

一些研究通过对野生型胺脱氢酶进行改造能够一定程度地提高酶活，但是随着酶活的提高往往伴随着稳定性的降低。上述胺脱氢酶突变体既具有较高的活性，又具有与野生型胺脱氢酶相当的热稳定性。经试验验证，上述胺脱氢酶突变体能够在42℃下保持30min而活性保持不变。

综上，上述胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率，且对底物具有较高的亲和力，能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺，并且具有较优的热稳定性，能够用于制备手性胺，以能够应用于食品、医药等领域。

一实施方式的酶制剂，包括上述实施方式的胺脱氢酶突变体。

其中，酶制剂为可溶性蛋白或者固定化酶。

在其中一个实施例中，酶制剂还包括辅酶。其中，辅酶为还原型辅酶Ⅰ(NADH)辅酶。

上述酶制剂包括上述实施方式的胺脱氢酶突变体，具有较高的催化效率，且对底物具有较高的亲和力，能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺，以能够用于制备手性胺，以能够应用于食品、医药等领域。

一实施方式的重组载体，包括上述实施方式的脱氢酶突变体的编码序列。

在其中一个实施例中，重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

在其中一个实施例中，重组载体含有纯化标签。通过设置纯化标签，有利于活性肽的分离纯化。进一步地，纯化标签为His标签、GST标签或SUMO标签。需要说明的是，纯化标签不限于上述指出纯化标签，其他常见的纯化标签也可以作用重组载体的纯化标签。

在其中一个实施例中，重组载体包括基因工程载体。编码上述脱氢酶突变体的核苷酸插入基因工程载体中。进一步地，基因工程载体为pET-32a载体、pET28a载体、pGEX-6P-1载体、pPIC-9K载体或pPIC-Zα载体。需要说明的是，基因工程载体不限于上述指出基因工程载体，其他常见的基因工程载体也可以作用重组载体的基因工程载体。

上述重组载体能够较好地保存编码上述脱氢酶突变体的核苷酸，有利于脱氢酶突变体的表达，能够应用于制备手性胺。

一种重组细胞，包括上述实施方式的胺脱氢酶突变体的编码序列。

在其中一个实施例中，重组细胞为克隆编码上述胺脱氢酶突变体的编码序列的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞为表达编码上述胺脱氢酶突变体的编码序列的细胞。

在其中一个实施例中，重组细胞包括受体细胞。编码上述胺脱氢酶突变体的编码序列或上述重组载体位于受体细胞内。

在其中一个实施例中，受体细胞为大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、动物细胞或植物细胞。进一步地，受体细胞为大肠杆菌Escherichia coli 10G、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌Top10、大肠杆菌Orgami(DE3)、毕赤酵母GS115或毕赤酵母SMD1168。

需要说明的是，受体细胞不限于上述指出受体细胞，其他常见的受体细胞也可以作用重组细胞的受体细胞。

上述重组细胞能够克隆或表达上述胺脱氢酶突变体，使得能够大规模的制备该胺脱氢酶突变体，并且通过重组细胞定向表达该胺脱氢酶突变体，以能够获得纯度较高的胺脱氢酶突变体，进而有利于胺脱氢酶突变体的应用，因此，上述重组细胞能够用于制备手性胺。

上述实施方式的重组细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S130：

S110：对上述实施方式的野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增，酶切后连接到空载体中，得到胺脱氢酶突变库质粒。

其中，对上述实施方式的野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤中，采用序列如SEQ ID No.3～SEQ ID No.4所示的引物对进行易错PCR扩增。具体地，如SEQ IDNo.3所示的序列为：5’-ACTGCTCATATGGAAAAAATCCGTGTTATCATC-3’；如SEQ ID No.4所示的序列为：5’-TCAGCTCTCGAGTTAAGCGTTGTTAACACCG-3’。

其中，易错PCR的反应体系为：0.05U/μL的DreamTaqTM、250μM的dATP、250μM的dGTP、1050μM的dCTP、1050μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQID No.4所示的引物、0.2ng/μL的空载体、0.2mM～0.8mM的氯化锰。

其中，易错PCR的反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、15s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃，5min，1个循环。

其中，空载体为pET-28a质粒。需要说明的是，空载体不限于为pET-28a质粒，也可以为本领域中其他常用的空载体。

在其中一个实施例中，对上述实施方式的野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增的步骤之前，还包括如下步骤：采用序列如SEQ ID No.5～SEQ IDNo.6所示的引物对PCR扩增野生型胺脱氢酶的编码序列。此种设置有利于富集野生型胺脱氢酶的编码序列，以有利于通过易错PCR扩增构建胺脱氢酶突变库质粒。

具体地，如SEQ ID No.5所示的序列为：5’-ACTGCTCATATGGAAAAAATCCGTGTTATCATC-3’，其中，带下划线碱基为限制性内切酶NdeI识别位点；如SEQ ID No.6所示的序列为：5’-TCAGCTCTCGAGTTAAGCGTTGTTAACACCG-3’，其中，带下划线碱基为限制性内切酶XhoI识别位点。

S120：将胺脱氢酶突变库质粒分别转化到宿主细胞中，得到转化细胞。

其中，宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短、抗污染能力强等优点，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。进一步地，宿主细胞为大肠杆菌Escherichia coli 10G。需要说明的是，宿主细胞不限于为上述指出的细胞，也可以为本领域中其他常用的宿主细胞。

其中，转化的方式为电转化。需要说明的是，转化的方式不限于为电转化，也可以为本领域中其他常用的转化方式。

S130：采用IVC-FACS方法对转化细胞进行高通量筛选，得到所述重组细胞。

定向进化是对酶进行分子改造，从而改善其各方面性质的有力工具。其原理是模拟自然界进化原理，在实验室中人工构建目的蛋白的基因突变库，再利用筛选手段挑选出其中符合预期性质的突变体。然而由于突变库中的阳性率较低，因此，常规的基于微孔板或底物平板的筛选方法由于通量低，费时费力，在定向进化筛选中往往不能得到良好效果。本研究通过建立了基于体外区室化-荧光激活细胞分选(IVC-FACS)技术的超高通量筛选方法，能够对酶突变体进行高效快速的筛选，其筛选通量可达每小时一百万个，能够用于对胺脱氢酶随机突变库的高通量筛选，进而获得活性提高的阳性突变体。

上述重组细胞的制备方法制备的重组细胞能够克隆或表达上述胺脱氢酶突变体，使得能够大规模的制备该胺脱氢酶突变体，并且通过重组细胞定向表达该胺脱氢酶突变体，以能够获得纯度较高的胺脱氢酶突变体，并且具有较优的热稳定性，有利于胺脱氢酶突变体的应用，能够用于制备手性胺。

以下为具体实施例部分。

实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。

未特别说明，以下实施例中，T4DNA连接酶购于NEB公司；pET28a质粒购于淼灵质粒公司；XhoI酶购于NEB公司；NdeI酶购于NEB公司。

实施例1

野生胺脱氢酶的编码序列的克隆

野生型胺脱氢酶(GenBank：CP002131.1)的编码序列以大肠杆菌为宿主进行密码子优化，并由苏州金唯智公司合成，采用序列如SEQ ID No.5～SEQ ID No.6所示的引物对PCR扩增野生型胺脱氢酶的编码序列，PCR扩增使用东洋纺(上海)生物科技有限公司的KOD高保真聚合酶，扩增条件为：95℃，2min；然后56℃、20sec，72℃、90sec，共30个循环；最后72℃，10min。其中，野生型胺脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；野生型胺脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

反应结束后，用质量百分含量为1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，得到1.0kb的条带，长度符合预期结果。按照核酸回收试剂盒(购于Takara公司)的使用说明书回收、纯化该目的片段。使用限制性核酸内切酶XhoI和NdeI对回收片段和pET28a质粒进行双酶切，然后用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(50ug/mL)的LB培养平板上培养12h。挑取阳性菌株，并采用质粒提取试剂盒(购于Takara公司)提取阳性克隆质粒，进行测序。经测序检测结果显示，克隆的胺脱氢酶ANDD-TDO基因序列正确，并且正确接入pET28a质粒，命名重组质粒为pET28a-ANDD-TDO，保存于甘油中。

实施例2

胺脱氢酶的表达、纯化及活力测定

将甘油管中的含有pET28a-ANDD-TDO重组质粒的工程菌按体积比1％接种到含有100μg/mL卡那霉素的4mL LB培养基试管中，37℃、220rpm培养12h。将培养后的菌液全部转接至含有50μg/mL卡那霉素的1L LB培养基摇瓶中，37℃、220rpm培养约2.5h，使OD600达到0.9左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃、200rpm诱导培养16h。将诱导结束后收获的大肠杆菌悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后，得到纯度为95％以上的野生型胺脱氢酶。测定野生型胺脱氢酶的活性，结果为：野生型胺脱氢酶的KM值为19.22μM，野生型胺脱氢酶的Kcat值为128.34s-1。其中，参考文献Catal.Sci.Technol.2016:10.1039.C6CY01625A测定野生型胺脱氢酶的活力。

实施例3

胺脱氢酶的大容量随机突变库的构建

通过易错PCR(ep-PCR)的方法构建胺脱氢酶的突变库，其中突变率的高低通过调节PCR体系中的锰离子的浓度来实现。具体地，采用对实施例1的野生型胺脱氢酶的编码序列进行易错PCR扩增。易错PCR的反应体系为：0.05U/μL的DreamTaqTM、250μM的dATP、250μM的dGTP、1050μM的dCTP、1050μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQ ID No.4所示的引物、0.2ng/μL的空载体、0.2mM～0.8mM的氯化锰；每管总体积为25μL，空载体为pET-28a质粒。易错PCR的反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、15s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃，5min，1个循环。

将易错PCR获得的扩增产物经琼脂糖电泳，切胶纯化回收后，用NdeI和BamHIII进行双酶切，然后用T4连接酶克隆到pET28a质粒上，再将纯化后的连接体系电转化到Escherichia coli 10G感受态细胞中。转化细胞经复苏后接种到50mL的LB培养基(含有100μg/mL的卡那霉素)中，在37℃培养过夜。取培养液质粒回收试剂盒(购于Takara公司)提取质粒，得到突变库质粒。同时，取培养液涂布含有20μg/mL的卡那霉素的LB琼脂糖平板上在37℃培养12h，计算突变库质粒的库容量约为200万个。取若干克隆使用焦磷酸测序的方法测定突变率，发现锰离子浓度为0.6mM时，获得突变率大约为平均每个基因2个变氨基酸残基。突变库的质粒转化宿主BL21(DE3)，接种到含100μg/mL Kan的4mL LB培养基试管中，在37℃、220rpm条件下培养12h；取菌液4mL转接至含50μg/mL Kan的1L LB培养基摇瓶中，在37℃、220rpm条件下培养2.5h，使OD600达到0.9左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，在25℃、200rpm条件下诱导培养16h表达后进行筛选，得到表达胺脱氢酶突变库的BL21(DE3)细胞。

实施例4

胺脱氢酶随机突变库的IVC-FACS高通量筛选

将表达胺脱氢酶突变库的BL21(DE3)细胞包裹入w/o/w(水包油包水型)二级微液滴进行酶反应。

具体地，采用微型膜挤出仪(Avanti Polar Lipids，AL，USA)，配套的两只注射器(Gastight 1001syringe，1mL，Hamilton,NV,USA)以及孔径为8微米的Track-Etch聚碳酸酯膜(Millipore，USA)来制备微液滴。

首先，将膜固定在膜挤出仪中，然后用注射器吸取0.5mL的油相(油相成分为：含有体积百分含量为2.9％的ABIL EM90乳化剂的轻石蜡油)润洗膜两次。乳化时，将100μL的内水相(即细胞浓度为OD 600:0.5的Escherichia coli BL21(DE3)-CodonPlus细胞悬液)与400μL的油相(油相成分为：含有体积百分含量为2.9％的ABIL EM90乳化剂的轻石蜡油)吸取到同一支注射器中，混合体系经膜挤出仪推注到另一个注射器中，然后再推回到第一个注射器中，这一过程称为一次乳化，生成w/o(油包水型)一级微液。生成的w/o一级微液滴通过显微镜(50i，Nikon，Japan，40×object)实时观察，通过优化乳化次数，使微液滴的直径分布在3～5μm。

制备的w/o一级微液滴通过8μm孔径的膜分散到次水相(即含有体积百分含量为1％TritonX-102的1×PBS，pH7.4)中，生成w/o/w二级微液滴。具体步骤为：将一片新的膜置于膜挤出仪中，用0.5mL次水相润洗两遍。将200μL的w/o一级微液滴和400μL的次水相分别吸取到两支注射器中；具体地，首先，将w/o一级微液滴通过膜挤出仪注入第二支注射器的次水相中，再通过膜挤出仪将混合体系推回原注射器中，完成一次乳化。生成的w/o/w二级微液滴的形态分布通过显微镜进行实时观察，通过优化乳化次数，使得最终w/o/w二级微液滴的直径在10μm左右且大小相对均一。在向0.2mL的含有w/o/w二级微液滴的外水相(外水相为水，w/o/w二级微液滴的含量为80％)中加入0.02mL的荧光底物(即含有10mM荧光素二丁酸酯的二甲基亚砜，购于Sigma公司)，在37℃、1000rpm的金属浴上震荡孵育30min，以进行酶反应，荧光底物荧光素二丁酸酯的终浓度为0.5mM。

用分选型流式细胞仪(BD FACSAriaTM II)检测反应体系的荧光信号，喷嘴的内径为100μm，样品的检测速度10000个细胞/sec具有最高荧光强度的液滴(约占含细胞液滴的0.1％)被分选入空的2mL eppendorf管中，以此为模板将阳性基因进行PCR扩增，PCR反应体系为：0.05U/μL的DreamTaqTM(购于Takara)、250μM的dATP、250μM的dGTP、250μM的dCTP、250μM的dTTP、0.4μM的序列如SEQ ID No.3所示的引物、0.4μM的序列如SEQ ID No.4所示的引物。其中，1000个细胞的分选后体积约为5μL。PCR反应条件为：95℃，3min，1个循环；95℃、15s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72℃，5min，1个循环。

将PCR产物重新克隆到pET-28a(+)质粒中，并平板培养后，将获得单克隆挑入96孔板中37℃、400rpm进行培养，每个孔含有200μL LB培养基；当细胞OD600达到0.6～0.8时加入1.0mM的IPTG，25℃诱导20h。诱导结束后，3000rpm离心30min收集细胞，弃上清。将细胞通过冻融裂解，向裂解后得到的裂解液中加入200μL的PBS混匀，3000rpm离心30min，取上清，得粗酶液。取10μL粗酶液与10μL的4-硝基苯基丁酸酯的乙腈溶液(4-硝基苯基丁酸酯的浓度为10mM，购于Sigma公司)及180μL的PBS在新的96孔板中37℃反应5min，反应结束后采用分光光度计在波长为405nm下检测不同克隆的酶活性。选择活性高于野生型胺脱氢酶的胺脱氢酶突变体并进行测序，并将阳性突变体经大量培养表达后用镍柱亲和层析进行纯化，得到E104A、N137P、V174C和V197D四种胺脱氢酶突变体。其中，“E104A”表示由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“N137P”表示由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“V174C”表示由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“V197D”表示由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到的胺脱氢酶突变体。

通过线上软件Swiss-modle构建野生型胺脱氢酶的蛋白晶体模型，详见图1。图1中，方框所框处的结构即为上述四种胺脱氢酶突变体在野生型胺脱氢酶上对应的突变位点。

测定上述四种胺脱氢酶突变体和野生型胺脱氢酶对前手性酮的动力学参数，参考文献Catal.Sci.Technol.2016:10.1039.C6CY01625A测定酶的动力学参数。测定结果详见表1。其中，前手性酮为XX前手性酮；表1中，“WT”表示野生型胺脱氢酶，“E104A”表示由野生型胺脱氢酶的第104位的谷氨酸突变为丙氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“N137P”表示由野生型胺脱氢酶的第137位的天冬酰胺突变为脯氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“V174C”表示由野生型胺脱氢酶的第174位的缬氨酸突变为半胱氨酸后得到的胺脱氢酶突变体；“V197D”表示由野生型胺脱氢酶的第197位的缬氨酸突变为天冬氨酸后得到的胺脱氢酶突变体。

表1野生型胺脱氢酶和胺脱氢酶突变体的酶学性质

经筛选，得到E104A、N137P、V174C和V197D四种胺脱氢酶突变体，其KM与野生型胺脱氢酶的KM值相当，四种胺脱氢酶突变体的Kcat值明显高于野生型胺脱氢酶的Kcat值，说明上述实施方式的胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率，且对底物具有较高的亲和力，能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺，以能够用于制备手性胺，以能够应用于食品、医药等领域。

综上，上述胺脱氢酶突变体具有较高的催化效率，且对底物具有较高的亲和力，能够在辅酶的作用下催化前手性酮和游离氨不对称合成手性胺，并且具有较优的热稳定性，能够用于制备手性胺，以能够应用于食品、医药等领域。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所

<120> 胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Lys Ile Arg Val Ile Ile Trp Gly Leu Gly Ala Met Gly Gly

1 5 1015

Gly Met Ala Arg Met Ile Leu Gln Lys Lys Gly Met Glu Ile Val Gly

202530

Ala Ile Ala Ser Arg Pro Glu Lys Ser Gly Lys Asp Leu Gly Glu Val

354045

Leu Asp Leu Gly Leu Lys Thr Gly Val Thr Ile Ser Cys Asp Pro Glu

505560

Thr Val Leu Lys Gln Pro Ala Asp Ile Val Leu Leu Ala Thr Ser Ser

65707580

Phe Thr Arg Glu Val Tyr Pro Gln Leu Gln Arg Ile Ile Ala Ser Gly

859095

Lys Asn Val Ile Thr Ile Ala Glu Glu Met Ala Tyr Pro Ala Tyr Arg

100 105 110

Glu Pro Glu Leu Ala Ala Lys Ile Asp Lys Met Ala Lys Asp His Gly

115 120 125

Val Thr Val Leu Gly Thr Gly Ile Asn Pro Gly Phe Val Leu Asp Thr

130 135 140

Leu Ile Ile Ala Leu Ser Gly Val Cys Met Asp Ile Lys Lys Ile Thr

145 150 155 160

Ala Arg Arg Ile Asn Asp Leu Ser Pro Phe Gly Thr Thr Val Met Arg

165 170 175

Thr Gln Gly Val Gly Thr Thr Val Asp Glu Phe Arg Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Glu Gly Thr Ile Val Gly His Ile Gly Phe Pro Glu Ser Ile Ser Leu

195 200 205

Ile Ser Glu Ala Leu Gly Leu Glu Ile Asp Glu Ile Arg Glu Met Arg

210 215 220

Glu Pro Ile Val Ser Asn Val Tyr Arg Glu Thr Pro Tyr Ala Arg Val

225 230 235 240

Glu Pro Gly Met Val Ala Gly Cys Lys His Thr Gly Ile Gly Tyr Arg

245 250 255

Lys Gly Glu Pro Val Ile Val Leu Glu His Pro Gln Gln Ile Arg Pro

260 265 270

Glu Leu Glu Asp Val Glu Thr Gly Asp Tyr Ile Glu Ile Glu Gly Thr

275 280 285

Pro Asn Ile Lys Leu Ser Ile Lys Pro Glu Ile Pro Gly Gly Ile Gly

290 295 300

Thr Ile Ala Ile Ala Val Asn Met Ile Pro Lys Val Ile Ser Ala Asn

305 310 315 320

Thr Gly Leu Val Thr Met Lys Asp Leu Pro Val Pro Ala Ala Leu Met

325 330 335

Gly Asp Ile Arg Lys Leu Ala Lys Asp Gly Val Asn Asn Ala

340 345 350

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaaaaaa tccgtgttat catctggggt ctgggtgcta tgggtggtgg tatggctcgt 60

atgatcctgc agaaaaaagg tatggaaatc gttggtgcta tcgcttctcg tccggaaaaa 120

tctggtaaag acctgggtga agttctggac ctgggtctga aaaccggtgt taccatctct 180

tgcgacccgg aaaccgttct gaaacagccg gctgacatcg ttctgctggc tacctcttct 240

ttcacccgtg aagtttaccc gcagctgcag cgtatcatcg cttctggtaa aaacgttatc 300

accatcgctg aagaaatggc ttacccggct taccgtgaac cggaactggc tgctaaaatc 360

gacaaaatgg ctaaagacca cggtgttacc gttctgggta ccggtatcaa cccgggtttc 420

gttctggaca ccctgatcat cgctctgtct ggtgtttgca tggacatcaa aaaaatcacc 480

gctcgtcgta tcaacgacct gtctccgttc ggtaccaccg ttatgcgtac ccagggtgtt 540

ggtaccaccg ttgacgaatt ccgtaaaggt ctggaagaag gtaccatcgt tggtcacatc 600

ggtttcccgg aatctatctc tctgatctct gaagctctgg gtctggaaat cgacgaaatc 660

cgtgaaatgc gtgaaccgat cgtttctaac gtttaccgtg aaaccccgta cgctcgtgtt 720

gaaccgggta tggttgctgg ttgcaaacac accggtatcg gttaccgtaa aggtgaaccg 780

gttatcgttc tggaacaccc gcagcagatc cgtccggaac tggaagacgt tgaaaccggt 840

gactacatcg aaatcgaagg taccccgaac atcaaactgt ctatcaaacc ggaaatcccg 900

ggtggtatcg gtaccatcgc tatcgctgtt aacatgatcc cgaaagttat ctctgctaac 960

accggtctgg ttaccatgaa agacctgccg gttccggctg ctctgatggg tgacatccgt 1020

aaactggcta aagacggtgt taacaacgct 1050

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actgctcata tggaaaaaat ccgtgttatc atc 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcagctctcg agttaagcgt tgttaacacc g 31

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actgctcata tggaaaaaat ccgtgttatc atc 33

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcagctctcg agttaagcgt tgttaacacc g 31

胺脱氢酶突变体、酶制剂、重组载体、重组细胞及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。