专利摘要

本发明涉及一种利用离子液体高效提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法，该方法包括以下步骤：1)超声强化提取：提取液为体积比为1：0.1～2.0：0.5～2.0的乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液，超声处理功率密度为10～200W/cm2，频率为10～100kHz；2)有机溶剂萃取：采用石油醚脱脂后用三氯甲烷反萃取得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相；3)HSCCC分离纯化：选择HSCCC溶剂体系，以离子液体Ⅱ作为流动相添加剂，经HSCCC分离纯化得雷公藤甲素和雷公藤乙素溶液；4)真空冷冻干燥。该方法大大减少了有机溶剂的使用，显著降低了提取过程中的污染和危害，改善了提取效果和提取效率，并且离子液体能大大缩短HSCCC的分离时间，得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

权利要求

1.一种利用离子液体高效提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)超声强化提取：雷公藤根、茎或叶样品经干燥粉碎后过40～80目筛，按固液比1：5～100加入体积比为1：0.1～2.0：0.5～2.0的乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液，于超声功率密度10～200W/cm²及超声频率10～100kHz下，20～95℃超声提取5～90min，固液分离得含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液；

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到所述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比1～5：1萃取1～5次，然后水相用三氯甲烷按体积比水相：三氯甲烷＝1～5：1萃取1～3次；分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在40～60℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品，萃取余液循环使用，该萃取余液主要成份为上述咪唑类离子液体Ⅰ；

3)HSCCC分离纯化：选择HSCCC溶剂体系，按体积/重量比0.2～2：1(mL/mg)将HSCCC溶剂体系和上述雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品加入到分液漏斗中，震荡、静置分层，平衡后，将上、下相分开，以溶剂体系的上相为固定相，溶剂体系的下相为流动相，调整转速，以一定流速泵入流动相，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液；

4)真空冷冻干燥：将上述各雷公藤甲素和雷公藤乙素溶液，在适当温度、干燥压力下真空冷冻干燥，回收有机萃取剂，分别得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述咪唑类离子液体Ⅰ包括1-乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-辛基-3-甲基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐中的至少一种盐。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液的体积比为10：0.5～2：2～10。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述HSCCC溶剂体系为体积比为2：3：3：2∶0.05的正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系；体积比为2：3：3：4∶0.05的甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系或者体积比为1：2：1∶0.05氯仿-乙醇-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系中的任意一种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述咪唑类离子液体Ⅱ中的离子包括1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑溴盐中的至少一种。

6.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤2)中还包括除去有机相而获得萃取余液，该萃取余液被循环用于步骤1中的方法获得含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

7.如权利要求6所述的方法，其中，该萃取余液主要成份为体积比1：0.1～2.0：0.5～2.0的乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液。

说明书

技术领域

本发明涉及制药工程技术领域，尤其涉及一种利用离子液体高效提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法。

背景技术

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)又叫黄藤，为卫矛科雷公藤属植物，具有祛风除湿、通络止痛、消肿止痛、解毒杀虫等功效。主要用于湿热结节、癌瘤积毒，临床上用其治疗麻风反应、类风湿性关节炎等，有抗肿瘤、抗炎等作用。雷公藤甲素(又称雷公藤内酯或雷公藤内酯醇，Triptolide，CAS No.38748-32-2)和雷公藤乙素(又称雷公藤羟内酯或雷公藤内酯二醇，Tripdiolide，CAS No.38647-10-8)是雷公藤植株内产生的两种具有较高生理活性的天然化学物，因其具有特殊的化学结构及作用机制，特别是在临床上对自身免疫性疾病(如红斑狼疮、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎和过敏性紫癜等)有独特疗效，目前已广泛用于治疗类风湿性关节炎等自身免疫性疾病，其见效快、疗效确切，几乎没有可以完全替代的类似中药，但在使用过程中，雷公藤引起的毒性反应事件频繁报道，成为近半个世纪以来发生中毒次数最多的中草药之一。雷公藤含有多种有效活性成分，具有其他很多药物无可比拟的临床作用，雷公藤甲素和雷公藤乙素作为雷公藤药剂的主要活性成分之一，因此，开展雷公藤甲素和雷公藤乙素的制备方法研究具有广阔的应用前景。雷公藤甲素和雷公藤乙素的结构式如下：

目前从雷公藤根、茎、叶中提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法主要采用挥发性有机溶剂进行提取，采用液/液萃取结合硅胶柱层析或液/液萃取结合高速逆流色谱法(HSCCC)进行分离纯化。如专利号为ZL200810046163.8(授权公告号为CN101367862)的中国发明专利“一种从雷公藤中快速大量分离高纯度雷公藤甲素的方法”提供了一种柱层析色谱结合制备色谱法和重结晶法分离制备高纯度雷公藤甲素的方法。该专利以雷公藤茎叶为原料，采用乙醇或甲醇温浸，有机溶剂反萃取，经柱层析分离后采用高效制备液相分离和两相溶剂结晶法纯化，得到纯度99.5％以上的雷公藤甲素。专利号为ZL200810164190.5(授权公告号为CN101445545)的中国发明专利“一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯醇的方法”提供了一种硅胶柱层析法结合高速逆流色谱(HSCCC)法精制雷公藤内酯醇的方法。该专利以雷公藤叶为原料，通过乙醇提取，乙酸乙酯反萃取，硅胶柱层析分离后采用HSCCC精制得到纯度在95％以上雷公藤内酯醇。专利申请号为201210230388.5(公开号为103524591A)的中国发明专利“一种雷公藤有效成分的制备方法”提供了一种硅胶柱层析法从雷公藤根中分离制备雷公藤甲素的方法。该专利以雷公藤根为原料，采用聚合物-无机盐水溶液和乙醇形成的双水相体系提取，然后用水不溶性有机溶剂反萃取，然后经过硅胶柱层析分离，重结晶后得到雷公藤甲素。专利申请号为201310237971.3(公开号为104231032A)的中国发明专利“一种从雷公藤叶中分离雷公藤内酯二醇的方法”提供了一种硅胶柱层析法结合HSCCC法精制雷公藤内酯二醇的方法。该专利以雷公藤叶为原料，通过乙醇提取，正己烷脱脂，硅胶柱层析分离后采用HSCCC精制得到纯度在95％以上雷公藤内酯二醇。这些发明采用了大量的有机溶剂进行提取分离制备，虽然这些发明相比已往文献均有较好的创新性，有些缩短了提取时间，有些减少了溶剂消耗，有些提高了提取率，但均存在有机溶剂的安全与环境污染问题。

由于离子液体的独特性能，目前已在制药工程技术领域得到了广泛的关注，并已在天然产物的提取分离中得到成功应用。如专利号为ZL200810114416.0(授权公告号为CN 101597296 B)的中国发明专利《一种离子液体高效提取生产青蒿素的新方法》利用咪唑类离子液体卤化物盐与水的混合物超声强化提取青蒿原料中的青蒿素。现今关于利用离子液体从雷公藤根、茎、叶中提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法还未见报道，因此，开展利用离子液体提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的研究，对解决当前雷公藤甲素和雷公藤乙素在提取分离制备过程中大量使用有机试剂而造成的安全隐患具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种安全、有效地利用离子液体提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用离子液体高效提取雷公藤甲素和雷公藤乙素的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)超声强化提取：雷公藤根、茎、叶等干燥粉碎后过40～80目筛，按固液比1：5～100加入体积比为1：0.1～2.0：0.5～2.0的乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液(创新点1)，于超声功率密度10～200W/cm²及超声频率10～100kHz下，20～95℃条件下超声提取5～90min，固液分离后得含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液；

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到所述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比1～5：1萃取1～5次，然后水相用三氯甲烷按体积比水相：三氯甲烷＝1～5：1萃取1～3次。分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在40～60℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。

3)HSCCC分离纯化：选择HSCCC溶剂体系，按体积(mL)/重量(mg)比0.2～2：1将HSCCC溶剂体系和上述雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品加入到分液漏斗中，震荡、静置分层，平衡后，将上、下相分开，以溶剂体系的上相为固定相，溶剂体系的下相为流动相，调整转速，以一定流速泵入流动相，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液；

4)真空冷冻干燥：将上述各雷公藤甲素和雷公藤乙素溶液，在适当温度、干燥压力下真空冷冻干燥，回收有机萃取剂，分别得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

作为优选，在以上方法中的步骤2种，除去有机相后的萃取余液可以被循环使用来进行如步骤1中的含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液，该萃取余液主要成份为上述咪唑类离子液体Ⅰ。优选的，萃取余液包括体积比为1：0.1～2.0：0.5～2.0的乙醇、水和咪唑类离子液体。

作为优选，所述咪唑类离子液体Ⅰ中的咪唑类离子包括1-乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-乙基-3-甲基咪唑溴盐、1-丁基-3-甲基咪唑溴盐、1-辛基-3-甲基咪唑氯盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐中的至少一种。

作为优选，所述步骤1)中乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液的体积比为10：0.5～2：2～10。

作为优选，所述HSCCC溶剂体系为体积比为2：3：3：2∶0.05的正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系、体积比为2：3：3：4∶0.05的甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系或者体积比为1：2：1∶0.05氯仿-乙醇-水-离子液体Ⅱ配制的HSCCC溶剂体系中的任意一种。

作为优选，所述咪唑类离子液体Ⅱ为1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-烯丙基-3-甲基咪唑溴盐中的至少一种。

有益效果

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用按一定比例混合而成的乙醇、水和咪唑类离子液体Ⅰ混合液作为提取液，结合超声辅助提取，来提取雷公藤根、茎、叶中的雷公藤甲素和雷公藤乙素，该提取液与现有的纯有机溶剂提取相比，大大节约了有机溶剂的使用量，绿色、环保，显著降低了传统的挥发性有机溶剂提取方法对环境及实验人员带来的污染及危害，同时离子液体的添加，大大改善了提取效果，提高了提取效率。进一步，本发明中以离子液体作为HSCCC流动相添加剂，可同时获得雷公藤甲素和雷公藤乙素，而且二者达到完全分离(分离度大于1.5)，大大缩短了HSCCC的分离时间，得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％，大大提高了生产效率。

附图说明

图1为本发明实施例3中HSCCC制备的雷公藤甲素和雷公藤乙素的紫外色谱图，其中，(1)为雷公藤甲素，(2)雷公藤乙素。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

1)超声强化提取：取雷公藤茎和叶1.0kg，干燥粉碎后过80目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：5(W/V)加入乙醇/水/1-乙基-3-甲基咪唑氯盐(8：2：7，V/V/V)的混合物，于超声功率密度100W/cm²，超声频率100kHz，温度45℃条件下，超声提取30min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比3：1萃取3次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在50℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-乙基-3-甲基咪唑氯盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择正己烷-醋酸乙酯-乙醇-水-1-烯丙基-3-甲基咪唑溴盐(2：3：3：2∶0.05，V/V)作为HSCCC溶剂体系，将200mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为800r/min，柱温为30℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以5.0mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-20℃，工作压力25Pa，升华温度50℃，解析温度70℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(v/v)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

实施例2：

1)超声强化提取：取雷公藤茎1.0kg，干燥粉碎后过60目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：10(W/V)加入乙醇/水/1-乙基-3-甲基咪唑溴盐(4：1：5，V/V/V)的混合物，于超声功率密度50W/cm²，超声频率50kHz，温度45℃条件下，超声提取20min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比5：1萃取3次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在50℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-乙基-3-甲基咪唑溴盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-水-1-烯丙基-3-甲基咪唑溴盐(2：3：3：4∶0.05，V/V)作为HSCCC溶剂体系，将250mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为750r/min，柱温为30℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以5.0mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-25℃，工作压力25Pa，升华温度50℃，解析温度65℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(v/v)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

实施例3：

1)超声强化提取：取雷公藤叶1.0kg，干燥粉碎后过40目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：8(W/V)加入乙醇/水/1-丁基-3-甲基咪唑溴盐(5：1：5，V/V/V)的混合物，于超声功率密度100W/cm²，超声频率50kHz，温度40℃条件下，超声提取30min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比3：1萃取3次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在45℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-乙基-3-甲基咪唑溴盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择氯仿-乙醇-水-1-烯丙基-3-甲基咪唑溴盐(1：2：1∶0.05，v/v)作为HSCCC溶剂体系，将250mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为700r/min，柱温为25℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以5.0mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-25℃，工作压力25Pa，升华温度50℃，解析温度60℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(v/v)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

实施例4：

1)超声强化提取：取雷公藤根1.0kg，干燥粉碎后过80目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：50(W/V)加入乙醇/水/1-辛基-3-甲基咪唑氯盐(10：1：5，V/V/V)的混合物，于超声功率密度20W/cm²，超声频率70kHz，温度65℃条件下，超声提取90min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比4：1萃取2次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在50℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-辛基-3-甲基咪唑氯盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择氯仿-乙醇-水-1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(1：2：1∶0.05，v/v)作为HSCCC溶剂体系，将250mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为800r/min，柱温为20℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以4.0mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-20℃，工作压力30Pa，升华温度55℃，解析温度75℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(v/v)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

实施例5：

1)超声强化提取：取雷公藤茎1.0kg，干燥粉碎后过60目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：70(W/V)加入乙醇/水/1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐(3：1：3，V/V/V)的混合物，于超声功率密度50W/cm²，超声频率200kHz，温度35℃条件下，超声提取70min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比3:1萃取3次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在55℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-烯丙基-3-甲基咪唑氯盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择氯仿-乙醇-水-1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1：2：1∶0.05，v/v)作为HSCCC溶剂体系，将400mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为750r/min，柱温为25℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以4.5mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-25℃，工作压力20Pa，升华温度55℃，解析温度75℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(v/v)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

实施例6：

1)超声强化提取：取雷公藤叶1.0kg，干燥粉碎后过40目筛，然后取100克粉末放入2500mL锥形瓶中，按固液比1：80(W/V)加入乙醇/水/1-丁基-3-甲基咪唑溴盐(5：1：4，V/V/V)的混合物，于超声功率密度200W/cm²，超声频率100kHz，温度55℃条件下，超声提取15min，经固液分离得到含雷公藤甲素和雷公藤乙素的提取液。

2)有机溶剂萃取：将石油醚加入到上述步骤1)得到的提取液中，按提取液与石油醚的体积比3：1萃取3次，分离有机相得雷公藤甲素和雷公藤乙素萃取相，然后将得到的有机萃取相在55℃下减压浓缩至近干，得到含有雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品。萃取余液循环使用，该萃取余液的主要成分为离子液体Ⅰ(1-丁基-3-甲基咪唑溴盐)。

3)HSCCC分离纯化：称取步骤2)得到的雷公藤甲素和雷公藤乙素的黄色粗品500mg，选择氯仿-乙醇-水--丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(1：2：1∶0.05，v/v)作为HSCCC溶剂体系，将500mL的HSCCC溶剂体系以及上述雷公藤黄色粗品分别加入分液漏斗中，震荡使溶液充分混合，放置过夜，分相平衡后分出上相和下相。以溶剂体系的上相为固定相，下相为流动相，调整转速为750r/min，柱温为25℃，用高速逆流色谱仪(上海同田生物技术有限公司生产的TBE-1000A型)以4.5mL/min流速泵入HSCCC螺旋管，根据检测器的谱图分步收集目标物，分别获得雷公藤甲素和雷公藤乙素的溶液。

4)真空冷冻干燥：将步骤3)得到的收集液，预冻温度-25℃，工作压力25Pa，升华温度55℃，解析温度60℃，得到纯度大于95％的雷公藤甲素和雷公藤乙素。

检测采用Agilent 1100series高效液相色谱仪，色谱柱为AccQ.Tag C₁₈柱(150mm×3.9mm i.d.,5μm，Waters,Milford,MA,USA)，流动相为0.05％(V/V)醋酸-醋酸铵溶液(5mmol/L)/乙腈/甲醇(60：30：10，V/V/V)，流速为0.6mL/min，紫外检测器在220nm波长下进行检测，雷公藤甲素和雷公藤乙素的纯度均大于95％。

一种利用离子液体提取雷公藤甲素和乙素的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。