专利摘要

本发明涉及一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用。具体而言，本发明公开了一种由嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)苯丙氨酸脱氢酶通过分子改造而成的苯丙胺脱氢酶突变体及其相应的氨基酸序列，以及所述苯丙胺脱氢酶突变体在不对称还原胺化潜手性羰基化合物合成手性胺及手性氨基醇中的用途。与其他手性胺及手性氨基醇的合成方法相比，本发明所使用的氨供体为廉价的氨水，所形成的副产物只有清洁的水，产物的光学纯度均>99％，因此代表了一条反应温和、立体选择性高、绿色环保的生物合成方法，在手性胺和手性氨基醇的实际生产中具有很好的应用前景。

权利要求

1.一种胺脱氢酶突变体，其特征在于，其是由下述任一氨基酸序列组成的蛋白质：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位天冬酰胺替换为亮氨酸；

(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；

(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276位的天冬酰胺替换为苏氨酸；

(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为苏氨酸，第276位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；

(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为苏氨酸，第276位的天冬酰胺替换为亮氨酸。

2.一种核酸，其特征在于，编码如权利要求1所述的胺脱氢酶突变体。

3.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的核酸。

4.一种重组表达转化体，其特征在于，包含如权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种重组胺脱氢酶突变体催化剂，其特征在于，是以下形式中的任意一种：

(1)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞；

(2)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液，将所述胺脱氢酶突变体的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。

6.一种如权利要求1所述胺脱氢酶突变体或如权利要求5所述重组胺脱氢酶突变体催化剂在催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇中的应用。

7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述潜手性羰基化合物的结构如下1-12所示，所述邻位羟基酮类化合物的结构如下13-16所示：

8.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应的氨基供体为氨水。

9.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应需要辅酶NADH的参与，反应过程中辅酶NADH被氧化为NAD+。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于，通过与葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应进行反应耦联，以葡萄糖作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生；

或者，通过与甲酸脱氢酶催化的甲酸氧化反应进行反应耦联，以甲酸作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种嗜热地芽孢杆菌(Geobacilluskaustophilus)来源的苯丙氨酸脱氢酶通过分子改造获得的具有胺脱氢酶活性的突变 体、含有所述突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述突变体或重 组表达转化体作为催化剂在潜手性酮和羟基酮不对称胺化还原制备手性胺和手性 氨基醇中的应用，特别是在(R)-1-(4-甲氧苯基)-2丙胺和L-苯丙氨醇生物合成方面的 应用。

背景技术

手性胺广泛存在于天然活性分子中，也是许多手性药品和精细化学品合成的重要前体。目前，市场上约40％的化学药物都含有一个或多个手性氨基结构砌块， 这类药物涉及抗炎、抗阿尔茨海默病、抗抑郁、抗艾滋病等，在医药领域占据着重 要地位。由于手性胺在药物合成中的重要性和巨大价值，其合成技术的开发已成为 新药研究领域的热点(Chem.Rev.,2003,103:2985-3012)。

手性胺制备的传统化学方法主要包括：外消旋体的动力学拆分和潜手性化合物的不对称合成。然而，这两种方法在实际应用中仍存在一些问题，动力学拆分方法 的理论得率仅为50％，而不对称还原胺化、C＝N双键不对称加成和不对称氢胺化 等方法普遍存在反应条件苛刻、需要使用过渡金属催化剂、操作过程繁琐和立体选 择性不足等问题。

相比于化学合成法，生物催化合成法具有反应条件温和、立体选择性高和环境 友好等优点，目前已经广泛应用于医药中间体和精细化学品等产品的工业化生产 中。目前，多种生物催化剂，包括水解酶、转氨酶、胺氧化酶、亚胺还原酶、还原 胺化酶、氨裂解酶和胺脱氢酶等已成功应用于手性胺的合成。

2012年美国佐治亚理工学院的Bommarius课题组通过蛋白质工程手段，对亮 氨酸脱氢酶进行分子改造获得具有胺脱氢酶活性的突变体(以下简称为胺脱氢酶，Angew.Chem.Int.Ed.,2012,51(16):3969-3972)，通过分子改造获得的胺脱氢酶可用 于催化制备手性胺，其优点在于：使用廉价的氨水作为胺供体，副产物是水，并且 产物的光学纯度都>99％，该文章报道以后引起了企业界和学术界的广泛关注。 Bommarius和Li使用分子改造获得的苯丙胺脱氢酶用来催化芳基酮的不对称还原 胺化(Adv.Synth.Catal.,2013,355(9):1780-1786；ACS Catal.,2015,5(2): 1119-1122)。Schell课题组通过双相(铵盐缓冲液/乙酸异戊酯)反应体系，解决了高 浓度底物对酶的抑制问题，实现了高浓度苯氧基丙酮到(R)-1-苯氧基-2-丙胺的高效 转化，底物浓度达到400mM，转化率为96％，产物的ee值高于99％(ACS Catal., 2017,7(5):3204-3209)。但是目前所开发的胺脱氢酶种数还非常有限，酶活性仍然 比较低，而且其在手性氨基醇合成中的应用未见报道。因此，有必要开发高活性、 高稳定性的胺脱氢酶，以满足手性胺和手性氨基醇化合物合成的技术需要和市场需 求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中胺脱氢酶活性较低的问题，提 供催化性能明显改善的胺脱氢酶突变体，以及所述胺脱氢酶突变体在手性胺和氨基 醇合成中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明的技术方案之一，提供催化性能显著提升的胺脱氢酶。

通过基因挖掘的方法从嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)中克隆获得 一个苯丙氨酸脱氢酶，命名为GkPheDH，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所 述嗜热地芽孢杆菌来自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-German Collection of Microorganismsand Cell cultures GmbH)，保藏编号为DSM 7263。在所述苯丙氨酸 脱氢酶GkPheDH中引入定点突变，将78位的赖氨酸突变为丝氨酸，将276位的 天冬酰胺突变为亮氨酸，突变后的蛋白质具有苯丙胺脱氢酶的活性，其氨基酸序列 如SEQ ID No.3所示，将其命名为GkAmDH_K78S/N276L。

在GkPheDH的基础上，进行了78位氨基酸和276位氨基酸的单点饱和定点 突变，进而对这两个位点的突变进行组合，通过筛选，最终选取4个对羟基酮底物 具有高活性的苯丙胺脱氢酶突变体。

所述对羟基酮底物具有高活性的胺脱氢酶突变体是具有如下氨基酸序列的蛋 白质：

(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸替换为丝氨酸，第276 位天冬酰胺替换为亮氨酸，命名为GkAmDH_K78S/N276L；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为丝氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，命名为GkAmDH_K78S/N276C。

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为丝氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为苏氨酸，命名为GkAmDH_K78S/N276T。

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为苏氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸，命名为GkAmDH_K78T/N276C。

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第78位赖氨酸突变为苏氨 酸，第276位的天冬酰胺突变为亮氨酸，命名为GkAmDH_K78T/N276L。

本发明的技术方案之二，提供了一种核酸，编码如本发明技术方案一所述的胺 脱氢酶突变体。

本发明的技术方案之三，提供了一种重组表达载体，包含如本发明技术方案二 所述的核酸。

所述重组表达载体可通过本领域常规方法将编码本发明所述胺脱氢酶突变体 基因的核酸连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载 体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，只要所述重组表达载体可以在相 应的表达宿主中正常复制，并表达所述的胺脱氢酶突变体即可。所述胺脱氢酶突变 体基因可以操作性连接于载体中合适的调控序列的下游，以实现所述胺脱氢酶突变 体的组成型或诱导型表达。所述载体优选质粒，更优选质粒pET28a。

本发明的技术方案之四，提供了一种重组表达转化体，包含如本发明技术方案 三所述的重组表达载体。

可通过将已经构建好的重组表达载体转化至宿主细胞来制备重组表达转化体。所述宿主细胞为本领域的各种常规宿主细胞，只要所述的重组表达载体能够稳定地 自行复制并能通过诱导剂诱导后有效表达目标蛋白质即可。本发明首选大肠杆菌作 为宿主细胞，更优选大肠杆菌E.coli BL21(DE3)用于高效表达本发明所述的胺脱 氢酶突变体。

本发明的技术方案之五，提供一种重组胺脱氢酶突变体催化剂。

所述重组胺脱氢酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种：

(1)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞；

(2)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液；

(3)培养本发明所述的重组表达转化体，分离含有所述胺脱氢酶突变体的转化 体细胞，对含有所述胺脱氢酶突变体的转化体细胞进行破碎，获得的细胞破碎液， 将所述胺脱氢酶突变体的细胞破碎液经冷冻干燥而得到的冻干酶粉。

其中所述重组表达转化体的培养为本领域常规的方法和培养条件，具体可以选用如下的步骤：对于重组大肠杆菌，优选培养基为TB培养基：蛋白胨12g/L，酵 母膏24g/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L，pH 6.5-7.0。优选的培养方法为： 将如上所述构建的重组大肠杆菌，接种至含有卡那霉素的培养基中，于37℃、180 rpm振荡培养过夜。按1～2％(v/v)的接种量接种至装有100mL TB培养基(含卡那 霉素)的500mL三角烧瓶中，于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6-0.8时，加入终浓度为0.1-0.5mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 作为诱导剂，16-25℃诱导16-24h后，将培养液离心，收集沉淀，然后用生理盐 水洗涤两次，获得重组表达转化体细胞。将收获的重组细胞进行冷冻干燥，即可获 得含有所述胺脱氢酶突变体的冻干细胞。将收获的重组细胞悬浮于5-10倍体积(v/w) 的缓冲液中，超声破碎后离心收集上清液，即可获得所述重组胺脱氢酶突变体的细 胞破碎液。收集的细胞破碎液于-80℃下预冷，然后通过真空冷冻干燥制备相应的 冻干酶粉，获得的冻干酶粉在4℃储存备用。

本发明所述胺脱氢酶突变体的活力测定方法如下：将含10mmol/L对氟苯丙 酮和0.1mmol/L辅酶NADH的1mL反应液(5M氨水/氯化铵缓冲液，pH 9.0)预热 至30℃，然后加入适量的胺脱氢酶突变体，通过分光光度计检测NADH在340nm 处的吸光度变化。1个酶活力单位(U)定义为上述条件下每分钟催化氧化1μmol NADH所需的酶量。

本发明的技术方案之六，提供如技术方案一所述胺脱氢酶突变体或如技术方案五所述重组胺脱氢酶突变体催化剂在催化潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类化合 物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇中的应用。

即提供了利用所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化不 对称还原潜手性酮类化合物，制备不同手性胺的方法，其制备途径可参照图1进行。

所述潜手性羰基化合物的结构如下1-12所示，所述邻位羟基酮类化合物的结 构如下13-16所示：

所述胺脱氢酶突变体催化剂可以催化上述潜手性羰基化合物和邻位羟基酮类 化合物不对称还原制备(R)-手性胺或手性氨基醇。

所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合 物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应的氨基供体为氨水。

所述胺脱氢酶突变体或所述重组胺脱氢酶突变体催化剂催化潜手性羰基化合 物和邻位羟基酮类化合物不对称还原反应需要辅酶NADH的参与，反应过程中辅 酶NADH被氧化为NAD⁺。

进一步地，可以通过与葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖氧化反应进行反应耦联，以 葡萄糖作为辅底物，实现辅酶NADH的原位再生；

或者，可以通过与甲酸脱氢酶催化的甲酸氧化反应进行反应耦联，以甲酸作为 辅底物，实现辅酶NADH的原位再生。

在所述应用中，潜手性羰基化合物的浓度可为10～500mmol/L，所述的胺脱氢 酶的用量可选用为0.5～50U/mmol潜手性羰基化合物。反应液中NADH或NAD⁺的用量为0.1～0.5mmol/L。反应过程中可利用葡萄糖或甲酸盐作为辅底物，通过葡 萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶催化的葡萄糖或甲酸根离子的氧化反应实现反应体系中 NADH的辅酶循环再生，所述葡萄糖脱氢酶或甲酸脱氢酶的用量可为1～200 U/mmol潜手性羰基化合物，所述葡萄糖或甲酸盐的摩尔量可为潜手性羰基化合物 的1～50倍。不对称还原过程中所需的氨水/甲酸铵缓冲液(但不限于氨水/甲酸铵 缓冲液)为本领域常规缓冲液，其浓度较佳为5mol/L。所述的不对称还原反应是 在振荡或搅拌条件下进行。所述的不对称还原反应的温度为20～40℃。所述的反应 时间以底物完全转化或反应自行终止的时间为准，优选反应时间小于24h。

还原反应结束后，采用常规方法对反应液中的还原产物胺进行分离提取。采用 水不溶性有机溶剂二氯甲烷进行萃取，优选有机溶剂为二氯甲烷，对萃取液进行浓 缩去除溶剂，获得目标产品。

与现有技术相比，本发明的创新和改进效果在于：

本发明提供了一种催化性能更好的胺脱氢酶突变体，能够高效催化芳香酮和 脂肪酮的不对称还原，制备光学纯的手性胺和手性氨基醇类化合物如：(R)-对氟苯 丙胺、(R)-对甲氧基苯丙胺、(R)-苄基丙胺，L-苯丙氨醇等。所述的胺类化合物可 作为许多药物的合成中间体，在市场上具有广泛的应用价值。所述的胺脱氢酶能够 催化浓度高达200mM的对甲氧基苯丙酮底物转化，转化率和产物(R)-对甲氧基苯 丙胺的光学纯度均高于99％，时空产率达到130.9g L^-1d^-1。另外，本发明首次利用 胺脱氢酶实现了手性氨基醇的合成，为手性氨基醇的合成提供了一种新方法。综上 所述，本发明所述的胺脱氢酶突变体具有活性高，耐受高浓度底物，产物光学纯度 高，时空产率高等优势，具有很好的工业应用前景。

附图说明

图1：胺脱氢酶催化潜手性羰基化合物转化制备手性氨基化合物示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

如非另有说明，下列实施例中的具体实验过程按照本领域常规方法和条件 进行，或遵照商品说明书。

本发明实施例中的材料来源如下：

嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)，来自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell cultures GmbH)，保藏编号为DSM 7263；

E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；限制性内切酶BamH I和Hind III 购于Takara公司。

实施例1苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH的基因克隆

根据苯丙氨酸脱氢酶GkPheDH的开放阅读框，设计上、下游引物：

上游引物如SEQ ID No.4所示，包含限制性内切酶BamH I的酶切位点；

下游引物如SEQ ID No.5所示，包含限制性内切酶Hind III的酶切位点。

以嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)的基因组DNA为模板，进行 PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl，上游引物和下游引物(10 ng/μl)各1.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O 21μl。PCR扩增程序为： 95℃预变性5min，然后进行32次如下循环：94℃变性30s，50℃退火30s， 72℃延伸60s；最后72℃再延伸10min。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后， 用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列中编码的开放阅读 框全长1143bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2苯丙氨酸脱氢酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1中PCR扩增所得的苯丙氨酸脱氢酶目的基因片段以及pET 28a 质粒同时用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶酶切过夜，然后经琼脂糖 凝胶电泳纯化和DNA试剂盒回收。将回收的目的基因和质粒的酶切片段质粒 在T4DNA连接酶的作用下，于16℃下连接24h，得到苯丙氨酸脱氢酶的重 组表达质粒pET28a-GkpheDH，然后将该重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3) 进行培养，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBL21 (DE3)/pET28a-GkpheDH。

实施例3胺脱氢酶突变体GkAmDH_K78S/N276L的创制和重组蛋白的表达

以实施例2所构建的重组表达质粒pET28a-GkpheDH作为DNA模板，使 用78位氨基酸突变引物，通过全质粒PCR，将氨基酸序列的第78位赖氨酸突 变为丝氨酸。获得的PCR产物通过限制性内切酶Dpn I降解去除DNA模板，纯 化后作为276位氨基酸突变的模板，使用276位氨基酸突变的引物，通过全质 粒PCR，将氨基酸序列的第276位天冬酰胺突变为亮氨酸，再通过Dpn I酶降解 去除DNA模板，将突变质粒转化至E.coli BL21(DE3)，即可获得第78位赖氨 酸突变为丝氨酸，第276位天冬酰胺突变为亮氨酸的胺脱氢酶，命名为GkAmDH_K78S/N276L。

78位氨基酸突变上游引物：AAGGGATGACGTATAGCTGCTTGGCCGCTGA， 如SEQ ID No.6所示；

78位氨基酸突变下游引物：TCAGCGGCCAAGCAGCTATACGTCATCCCTT， 如SEQ ID No.7所示；

276位氨基酸突变上游引物： TCGTCGGTTCGGCGCTGAATCAGCTGGCTGA，如SEQ IDNo.8所示；

276位氨基酸突变上游引物： TCAGCCAGCTGATTCAGCGCCGAACCGACGA，如SEQ IDNo.9所示；

将GkAmDH_K78S/N276L的重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)，然后接种 至含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L) 中，于37℃摇床中振荡培养12h后，以1％(v/v)的接种量接种至装有100mL TB培养基的500mL三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液 的OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃下 继续培养24h，离心收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞。将收集的 细胞重新悬浮于10mL的Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，冰水浴中进行 超声破碎，离心收集上清液，冷冻干燥制备冻干细胞粗提物。

实施例4-7催化羟基酮底物的胺脱氢酶GkAmDH突变体活力筛选

根据实施例3中的PCR过程，以质粒pET28a-GkpheDH作为DNA模板，对 第78位赖氨酸和第276位的天冬酰胺；使用NDT兼并引物，构建双点组合的饱 和突变库。构建的克隆子转化至E.coli BL21(DE3)，在96孔板中进行诱导表达。 表达后的蛋白，分别针对实施例4-7中的四个羟基酮底物进行活力测定。具体活 力测定如下：在氨水/甲酸铵缓冲液中(2M,pH9.0)中，反应体系包括0.2mM NADH和10mM底物，在40℃下，测定单位时间内340nm处吸光度的变化 值，计算酶活力。经过活力比较、筛选，针对每一个化合物都获得了一个最优 的胺脱氢酶GkAmDH的突变体，其针对相应底物的活力如表1所示。

针对实施例4的底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为丝氨酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸所得到的 蛋白质，命名为GkAmDH_K78S/N276C。

针对实施例5中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为丝氨酸，第276位的天冬酰胺突变为苏氨酸所得到的蛋 白质，命名为GkAmDH_K78S/N276T。

针对实施例6中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为苏氨酸，第276位的天冬酰胺突变为半胱氨酸所得到的 蛋白质，命名为GkAmDH_K78T/N276L。

针对实施例7中底物，最优突变体为如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序 列的第78位赖氨酸突变为苏氨酸，第276位的天冬酰胺突变为亮氨酸所得到的蛋 白质，命名为GkAmDH_K78T/N276C。

表1.针对不同羟基酮底物的GkAmDH最优突变体

实施例8-19胺脱氢酶GkAmDH_K78S/N276L催化的不对称氨化反应

图1示出了胺脱氢酶催化潜手性羰基化合物转化制备手性氨基化合物示意图。

在500μL的氨水/氯化铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，加入0.18U-3.7U胺脱氢 酶GkAmDH_K78S/N276L冻干粗提物，1U的甲酸脱氢酶FDH的冻干粗提物，5umol 的底物，1mM NAD⁺，于40℃，1000rpm下振摇反应24h。反应结束后用等 体积的二氯甲烷萃取，萃取液加入无水硫酸钠干燥8h，250μL萃取液用于气 相色谱分析底物转化率。另外250μL萃取液加入50μL乙酸酐和10μL吡啶， 然后在室温下反应2h，生理盐水洗涤干燥后，通过气相色谱分析产物光学纯 度(ee值)。

表2.GkAmDH_K78S/N276L催化还原胺化反应的结果

实施例20 GkAmDH_K78S/N276L催化合成(R)-1-(4-甲氧苯基)-2丙胺

将包含92mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)，2g胺脱氢酶 GkAmDH_K78S/N276L冻干粗提物(40U)，100mg FDH冻干细胞粗提物(74U)，100 μmol NAD⁺，3.3g 4-甲氧基苯丙酮和5mL二甲亚砜的反应物，于40℃下，200rpm 搅拌反应。6h后底物转化率达到99％，结束反应。反应液加入10M氢氧化 钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，加入无 水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到1.30g产品(R)-1-(4-甲氧苯基)-2 丙胺，产品收率41％，产物的ee值高于99％，时空得率为130.9g L^-1d^-1。

实施例21 GkAmDH_K78S/N276C催化合成(S)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇

将1g胺脱氢酶GkAmDH_K78S/N276C冻干粗提物(80U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD⁺，5.25g 1-羟基-1-苯丙酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到2.15g 产品(S)-2-氨基-1-苯基丙烷-1-醇，产品收率41％，产物的ee值高于99％。

实施例22 GkAmDH_K78S/N276T催化合成(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇

将2g胺脱氢酶GkAmDH_K78S/N276T冻干粗提物(90U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD⁺，5.25g 1-羟基-3-苯基丙酮和5mL二甲亚砜加入 到95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24 h。反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取 三次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到2.36 g产品(S)-2-氨基-3-苯基丙烷-1-醇，产品收率45％，产物的ee值高于99％。

实施例23 GkAmDH_K78T/N276L催化合成(S)-2-氨基-1-丁醇

将5g胺脱氢酶GkAmDH_K78T/N276L冻干粗提物(85U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD⁺，1.60g 1-羟基-2-丁酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到0.62g 产品(S)-2-氨基-1-丁醇，产品收率39％，产物的ee值高于99％。

实施例24 GkAmDH_K78T/N276C催化合成(S)-2-氨基-2-丁醇

将10g胺脱氢酶GkAmDH_K78T/N276C冻干粗提物(50U)，100mg FDH冻干细 胞粗提物(74U)，100μmol NAD⁺，1.60g 3-羟基-2-丁酮和5mL二甲亚砜加入到 95mL氨水/甲酸铵缓冲液(5M,pH 9.0)中，于40℃下，200rpm搅拌反应24h。 反应液加入10M氢氧化钠将pH调节至12，然后使用等体积二氯甲烷萃取三 次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜，减压蒸馏去除溶剂，得到0.77g 产品(S)-2-氨基-2-丁醇，产品收率48％，产物的ee值高于99％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此 说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限 于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改 进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司

<120> 一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1143

<212> DNA

<213> 好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)

<400> 1

atgaatgtca tgctatcgcc aaacatgtca caaagattgg atttgttttt ccaaatgcgt 60

gaacatgaac aggtggtgtt ttgtctcgat gaagcgaccg gcctaagggc gatcatcgcc 120

attcatagca cggctcttgg gccggcgctc ggcggctgtc ggatgcatcc gtatgccacg 180

acggaagagg cgctcgccga tgcgcttcgg ctgtcgaaag ggatgacgta taaatgcttg 240

gctgccgatg tcgattttgg cggcggcaag gcggtgatca tcggcgatcc gcgcaaagac 300

aaatcgccgg aattgtttcg cgctttcggc cagttcgtgg agtcattagg cggccggttt 360

tacacgggca cggatatggg gacgacgccg gacgattttg tgcacgcgct gaaagagacg 420

aattgcatcg tcggcgttcc ggaagcgtat ggcggaagcg gcgactcatc cgtgccgacc 480

gccgagggcg ttgtttacgg cattcaggcg acgaacgatg ttgtgtttgg cagcaagcat 540

ttgcatggca aaacgtatgc ggtgcaaggg ctcggaaaag tcggaaaaaa agtggcgctt 600

cgtttgcttg aagaaggggc ggatctgtat gtgtgcgatt tgaacgaagc ggcagtcaaa 660

gaggtcgtgg cgtacggcaa gcaaatcggg gcgtccgtca agccggtgaa cggaacggat 720

atttatcgcg tcgaagccga tgtgttcgtc ccgtgcgcat ttggcggcgt catcaacgat 780

gaaacgatcg ccgagctgcg agtgaaagcg gtcgtcggtt cggcgaacaa tcagctggct 840

gacaaacgcc acgcccgtat gttgaaagaa aagggcatca tgtatgcccc cgattatatc 900

gtcaacgccg gcggcctcat tcaagtggcc gatgaactgt acggagcgaa caaagagcgg 960

gtgctggcga aaacgaaagc gatttatgat acgctgctcg ccatttatgc gcgggctgaa 1020

tcggaaggaa taacgacgat cgaggcagcc gatcaatttt gcgaagagcg gatcgagaaa 1080

cgcaaacgcc gcaatcattt tttcacgcac caaaagcggc cgaagtggga tattcgacgt 1140

taa 1143

<210> 2

<211> 380

<212> PRT

<213> 好热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)

<400> 2

Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe

1 5 10 15

Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala

20 25 30

Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro

35 40 45

Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala

50 55 60

Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Lys Cys Leu

65 70 75 80

Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp

85 90 95

Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe

100 105 110

Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr

115 120 125

Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val

130 135 140

Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr

145 150 155 160

Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe

165 170 175

Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly

180 185 190

Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp

195 200 205

Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala

210 215 220

Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp

225 230 235 240

Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly

245 250 255

Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val

260 265 270

Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu

275 280 285

Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly

290 295 300

Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg

305 310 315 320

Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr

325 330 335

Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln

340 345 350

Phe Cys Glu Glu Arg Ile Glu Lys Arg Lys Arg Arg Asn His Phe Phe

355 360 365

Thr His Gln Lys Arg Pro Lys Trp Asp Ile Arg Arg

370 375 380

<210> 3

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

Met Asn Val Met Leu Ser Pro Asn Met Ser Gln Arg Leu Asp Leu Phe

1 5 10 15

Phe Gln Met Arg Glu His Glu Gln Val Val Phe Cys Leu Asp Glu Ala

20 25 30

Thr Gly Leu Arg Ala Ile Ile Ala Ile His Ser Thr Ala Leu Gly Pro

35 40 45

Ala Leu Gly Gly Cys Arg Met His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Glu Ala

50 55 60

Leu Ala Asp Ala Leu Arg Leu Ser Lys Gly Met Thr Tyr Ser Cys Leu

65 70 75 80

Ala Ala Asp Val Asp Phe Gly Gly Gly Lys Ala Val Ile Ile Gly Asp

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Pro Arg Lys Asp Lys Ser Pro Glu Leu Phe Arg Ala Phe Gly Gln Phe

100 105 110

Val Glu Ser Leu Gly Gly Arg Phe Tyr Thr Gly Thr Asp Met Gly Thr

115 120 125

Thr Pro Asp Asp Phe Val His Ala Leu Lys Glu Thr Asn Cys Ile Val

130 135 140

Gly Val Pro Glu Ala Tyr Gly Gly Ser Gly Asp Ser Ser Val Pro Thr

145 150 155 160

Ala Glu Gly Val Val Tyr Gly Ile Gln Ala Thr Asn Asp Val Val Phe

165 170 175

Gly Ser Lys His Leu His Gly Lys Thr Tyr Ala Val Gln Gly Leu Gly

180 185 190

Lys Val Gly Lys Lys Val Ala Leu Arg Leu Leu Glu Glu Gly Ala Asp

195 200 205

Leu Tyr Val Cys Asp Leu Asn Glu Ala Ala Val Lys Glu Val Val Ala

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Tyr Gly Lys Gln Ile Gly Ala Ser Val Lys Pro Val Asn Gly Thr Asp

225 230 235 240

Ile Tyr Arg Val Glu Ala Asp Val Phe Val Pro Cys Ala Phe Gly Gly

245 250 255

Val Ile Asn Asp Glu Thr Ile Ala Glu Leu Arg Val Lys Ala Val Val

260 265 270

Gly Ser Ala Leu Asn Gln Leu Ala Asp Lys Arg His Ala Arg Met Leu

275 280 285

Lys Glu Lys Gly Ile Met Tyr Ala Pro Asp Tyr Ile Val Asn Ala Gly

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Gly Leu Ile Gln Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Ala Asn Lys Glu Arg

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Val Leu Ala Lys Thr Lys Ala Ile Tyr Asp Thr Leu Leu Ala Ile Tyr

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Ala Arg Ala Glu Ser Glu Gly Ile Thr Thr Ile Glu Ala Ala Asp Gln

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cgggatccat gaatgtcatg ctatcgccaa aca 33

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cccaagcttt taacgtcgaa tatcccactt cggc 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

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aagggatgac gtatagctgc ttggccgctg a 31

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tcagcggcca agcagctata cgtcatccct t 31

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<211> 31

<212> DNA

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<400> 8

tcgtcggttc ggcgctgaat cagctggctg a 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

tcagccagct gattcagcgc cgaaccgacg a 31

一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺和氨基醇合成中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。