专利摘要

本发明提供了一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐具有化学式(I)的化合物其中：R1、R2为H或OH；R3为H或鼠李糖；R4为葡萄糖或鼠李糖或木糖；R5为H或葡萄糖或鼠李糖基‑(1→4)‑[鼠李糖基‑(1→3)‑]‑葡萄糖基‑。本发明的化合物具有较强的抗肝星状细胞增殖的作用、抗肝纤维化的作用，以及针对血小板衍生因子(PDGF)、Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、转化生长因子‑β1(TGF‑β1)、人α平滑肌肌动蛋白(α‑SMA)均有较低的IC50值。

权利要求

1.一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有化学式(I)的化合物

其中，R1为OH，R2、R3为H，R4为鼠李糖，R5为葡萄糖，该化合物是3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[-α-L-鼠李糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,29)-二羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

2.一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有化学式(I)的化合物

其中，R1、R2为OH，R3为鼠李糖，R4为木糖，R5为H，该化合物是3-O-β-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,23,29)-三羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

3.一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有化学式(I)的化合物

其中，R1、R2为H，R3为H，R4为葡萄糖，R5为鼠李糖基-(1→4)-[鼠李糖基-(1→3)-]-葡萄糖基-，该化合物是3-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-[β-L-鼠李糖-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D-葡萄糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-16β-羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

4.根据权利要求1-3任一项所述的三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，作为制备治疗肝纤维化疾病药物的应用。

5.药物组合物，包含根据权利要求1-3任一项所述化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求1-3所述的三萜皂苷类化合物，其特征在于，所述化合物从竹叶柴胡中分离提取。

7.一种制备权利要求1-3中任一项所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一 称取竹叶柴胡药材，粉碎后用10倍体积的75％乙醇5％氨水溶液加热回流提取，得滤液；

步骤二 除去滤液中的乙醇，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶液进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水层萃取部分；

步骤三 对水层萃取部分采用大孔吸附树脂AB-8，以水-乙醇体系作为流动相进行梯度洗脱，获得不同组分，经LC-MS检测分析筛选出糖苷类化合物主要富集的组分。

8.根据权利要求7所述的三萜皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，还包括步骤四将40:60的洗脱部分过正向硅胶柱色谱，采用体积比为5:3:0.3的三氯甲烷-甲醇-水系统等度洗脱，洗脱液经薄层色谱检视后，得到8个组分,第7组分经半制备型高效液相色谱在18％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集15-17min出现的化合物吸收峰，得到所述权利要求1中的化合物；收集19-23min出现的化合物吸收峰，得到所述权利要求2中的化合物；第8组分采用Sephadex LH-20凝胶柱，通过甲醇-水系统以100:0，60:40，20:80，0:100梯度洗脱，得到的20:80洗脱部分经半制备型高效液相色谱在16％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集11-14min出现的化合物吸收峰，得到所述权利要求3中的化合物。

说明书

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种三萜皂苷类化合物及其制备方法和应用。

背景技术

肝脏是人体中最大的实质性器官，也是解毒各种代谢物，合成蛋白质，调节糖原储存、分解红细胞及产生激素等新陈代谢活动的重要器官。肝纤维化是继发于各种慢性致病因素引起的肝损伤和炎症反应过程中的出现的损伤修复反应。其核心是细胞外基质合成与降解的失衡，引起过量细胞外基质病理性积累，肝组织瘢痕化和增厚，影响正常的器官功能。肝纤维化是各类急性慢性肝病发展的必经病理过程，若得不到有效控制，将伴有发展为肝硬化、肝门静脉高压、肝癌等重大疾病的风险。

研究证实，肝纤维化的早期是可逆的。寻找有效抗肝纤维化药物是目前医学和生物学领域的研究热点之一，由于肝纤维化的形成机制复杂，目前为止，治疗肝纤维化的药物大多处于临床试验阶段，FDA批准的抗肝纤维化药物依旧缺乏。此外，现有技术中的抗肝纤维化化学药物如秋水仙素等毒副作用较强，不易作为药物使用。

竹叶柴胡(Bupleurum marginatum Wall.ex DC.)为柴胡属伞形科植物，以干燥全草入药。为傣药中的常用药，性苦微寒，具有疏风散热，疏肝，升阳功效，用于感冒发热，寒热往来，疟疾，胸协胀痛等。已有研究证明竹叶柴胡能显著改善血清及肝组织中各项肝纤维化指标，在组织学染色中显示了对肝纤维化较好的治疗效果。

因此，目前急需一种抗肝纤维化活性好和毒性低的抗肝纤维化药物。

发明内容

为了克服现有技术上的问题，本发明提供一种三萜皂苷类化合物，可作为抗肝纤维化疾病的药物，具有较高抗肝纤维化活性及较低的毒副作用。

本发明提供以下技术方案：

一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，具有化学式(I)的化合物

其中：R1、R2为H或OH；R3为H或鼠李糖；R4为葡萄糖或鼠李糖或木糖；R5为H或葡萄糖或鼠李糖基-(1→4)-[鼠李糖基-(1→3)-]-葡萄糖基-。

进一步地，当R1为OH，R2、R3为H，R4为鼠李糖，R5为葡萄糖，该化合物是3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[-α-L-鼠李糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,29)-二羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

进一步地，当R1、R2为OH，R3为鼠李糖，R4为木糖，R5为H，该化合物是3-O-β-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,23,29)-三羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

进一步地，当R1、R2为H，R3为H，R4为葡萄糖，R5为鼠李糖基-(1→4)-[鼠李糖基-(1→3)-]-葡萄糖基-，该化合物是3-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-[β-L-鼠李糖-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D-葡萄糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-16β-羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。

三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，作为制备治疗肝纤维化疾病药物的应用。

一种药物组合物，包含上述化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，所述化合物从竹叶柴胡中分离提取。

一种制备三萜皂苷类化合物的制备方法包括以下步骤：

步骤一称取竹叶柴胡药材，粉碎后用10倍体积的75％乙醇5％氨水溶液加热回流提取，得滤液；

步骤二除去滤液中的乙醇，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶液进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水层萃取部分；

步骤三对水层萃取部分采用大孔吸附树脂AB-8，以水-乙醇体系作为流动相进行梯度洗脱，获得不同组分，经LC-MS检测分析筛选出糖苷类化合物主要富集的组分。

进一步地，还包括步骤四将40:60的洗脱部分过正向硅胶柱色谱，采用三氯甲烷-甲醇-水系统(5:3:0.3)等度洗脱，洗脱液经薄层色谱检视后，得到8个组分,第7组分经半制备型高效液相色谱在18％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集15-17min出现的化合物吸收峰，得到化合物1；收集19-23min出现的化合物吸收峰，得到化合物2；第8组分采用Sephadex LH-20凝胶柱，通过甲醇-水系统以100:0，60:40，20:80，0:100梯度洗脱，得到的20:80洗脱部分经半制备型高效液相色谱在16％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集11-14min出现的化合物吸收峰，得到化合物3。

采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备的化合物，经实验证明其具有较强的抗肝星状细胞增殖的作用、抗肝纤维化的作用，以及针对血小板衍生因子(PDGF)、Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)均有较低的IC50值，具有良好的结合并抑制其生物活性的作用，能在大鼠肝纤维化模型中显著改善肝纤维化生理指标且治疗效果优于阳性药，因此可作为抗肝纤维化药物进行应用。

2、本发明化合物用于药物时，可以单独使用或支撑其他临床可用的不同剂型的药物，剂型包括散剂、注射剂、胶囊剂、丸剂、微胶囊、片剂、膜剂、软胶囊剂、膏剂、栓剂、气雾剂、口服液、颗粒剂。可按照药物制剂学添加医学上可接受的药物辅料，包括填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、pH调节剂或润滑剂等。

3、本发明提供了极性较高、分离难度较大的竹叶柴胡水层萃取部分的分离纯化方法，并得到了结构新颖的在齐墩果烷型三萜皂苷母核的3位和28位均连糖基且糖基数量在4个及以上的3个化合物，具有较强的极性和水溶性，且已证实其具有抗肝纤维化的药物活性，可为开发保肝护肝药物提供先导化合物。

附图说明

图1是本发明化合物1的1H NMR谱图；

图2是本发明化合物1的13C NMR谱图；

图3是本发明化合物1的DEPT135谱图；

图4是本发明化合物1的1H-1H COSY谱图；

图5是本发明化合物1的HSQC谱图；

图6是本发明化合物1的HMBC谱图；

图7是本发明化合物1的MS谱图；

图8是本发明化合物2的1H NMR谱图；

图9是本发明化合物2的13C NMR谱图；

图10是本发明化合物2的DEPT135谱图；

图11是本发明化合物2的1H-1H COSY谱图；

图12是本发明化合物2的HSQC谱图；

图13是本发明化合物2的HMBC谱图；

图14是本发明化合物2的MS谱图；

图15是本发明化合物3的1H NMR谱图；

图16是本发明化合物3的13C NMR谱图；

图17是本发明化合物3的DEPT13谱图；

图18是本发明化合物3的1H-1H COSY谱图；

图19是本发明化合物3的HSQC谱图；

图20是本发明化合物3的HMBC谱图；

图21是本发明化合物3的MS谱图；

图22是本发明中化合物1与TGF-β1蛋白结合模式图；

图23是本发明中化合物2与TGF-β1蛋白结合模式图；

图24是本发明中化合物3与TGF-β1蛋白结合模式图；

图25是本发明中化合物1与PDGF蛋白结合模式图；

图26是本发明中化合物2与PDGF蛋白结合模式图；

图27是本发明中化合物3与PDGF蛋白结合模式图；

图28是本发明中3个化合物的MTS结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的结构图及具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明提供了一种三萜皂苷类化合物或其药学上可接受的盐，具有化学式(I)的化合物

其中：R1、R2为H或OH；R3为H或鼠李糖；R4为葡萄糖或鼠李糖或木糖；R5为H或葡萄糖或鼠李糖基-(1→4)-[鼠李糖基-(1→3)-]-葡萄糖基-。

该化合物可以作为制备治疗肝纤维化疾病药物的应用。该化合物可从傣药竹叶柴胡中分离提取。本发明提供一种药物组合物，包含上述化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。

实施例2

制备本发明三萜皂苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤一称取竹叶柴胡药材，粉碎后用10倍体积的75％乙醇5％氨水溶液加热回流提取，得滤液；

步骤二除去滤液中的乙醇，依次使用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶液进行萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水层萃取部分；

步骤三对水层萃取部分浸膏采用大孔吸附树脂AB-8以乙醇-水(0:100-100:0)梯度洗脱，分别收集20:80，40:60，60:40，80:20四个部分的洗脱液，经LC-MS检测分析，第2部分(40:60)为糖苷类化合物主要富集的组分。

步骤四将40:60的洗脱部分过正向硅胶柱色谱，采用三氯甲烷-甲醇-水系统(5:3:0.3)等度洗脱，洗脱液经薄层色谱检视后，得到8个组分。第7组分经半制备型高效液相色谱在18％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集15-17min出现的化合物吸收峰，得到化合物1；收集19-23min出现的化合物吸收峰，得到化合物2。第8组分采用SephadexLH-20凝胶柱，通过甲醇-水系统以100:0，60:40，20:80，0:100梯度洗脱，得到的20:80洗脱部分经半制备型高效液相色谱在16％乙腈条件下等度洗脱，紫外检测波长为210-260nm，收集11-14min出现的化合物吸收峰，得到化合物3。

本发明提供了极性较高、分离难度较大的竹叶柴胡水层萃取部分的分离纯化方法，并得到了结构新颖的在齐墩果烷型三萜皂苷母核的3位和28位均连糖基且糖基数量在4个及以上的3个化合物，为开发保肝护肝药物提供了先导化合物。

实施例3

当R1为OH，R2、R3为H，R4为鼠李糖，R5为葡萄糖，该化合物是3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[-α-L-鼠李糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,29)-二羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷(在本发明中定义为：化合物1)，其化学式如下：

化合物1为白色无定型粉末，溶于甲醇；HRMS[M-H]-峰m/z1103.567(计算值C54H87O23-为1103.565)，分子式：C54H88O23。

化合物1的分析数据：如图1所示，化合物1的1H NMR(176MHz，methanol-D4)谱中给出的七个角甲基信号δH 0.76(3H，s)，0.85(3H，s)，0.86(3H，s)，0.94(3H，s)，1.08(3H，s)，1.26(3H，d)，1.29(3H，d)是三萜皂苷类化合物的特征信号，其中H谱化学位移1.29处有裂分为双峰的甲基信号，推测为呋糖或鼠李糖上的甲基信号。H谱信号δH5.62(1H，d，J＝10.5Hz)，δH 6.47(1H，d，J＝10.5Hz)与图2所示的13CNMR(176MHz，methanol-D4)谱中δC136.5，130.2，126.0，125.3表明化合物具有两个共轭双键结构。图3中，DEPT135给出8个季碳信号，分别对应异环双烯齐墩果烷型三萜皂苷母核上4，8，10，13，14，17，18，20位上8个季碳。根据13C NMR谱中δC 105.2，103.5，103.3，101.6与1H NMR谱中的四个糖端基质子信号δH 4.92(1H，brs)，4.38(1H，d，J＝7.9Hz)，4.34(1H，d，J＝7.8Hz)，4.19(1H，d，J＝7.8Hz)可推断化合物1中含有四个糖基结构。根据三萜皂苷类化合物的核磁图谱特征，推断化合物1连有四个糖基的异环双烯型三萜皂苷结构。其中三个葡萄糖端基质子观察到的大的耦合常数(J＝7.8～7.9Hz)可以确定其构型均为β构型，鼠李糖端基质子信号为δH 4.92(1H，brs)，可以确定其构型为α构型。16位C化学位移值为δC 76.6，可确定C16-OH为β构型。随后根据如图4-6所示的HSQC，HMBC，1H-1H COSY等二维谱图的综合分析，对化合物1进行了全归属，最终确定化合物1的结构为3-O-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[-α-L-鼠李糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,29)-二羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。化合物1的1H、13CNMR数据见表1。

实施例4

当R1、R2为OH，R3为鼠李糖，R4为木糖，R5为H，该化合物是3-O-β-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,23,29)-三羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷(在本发明中定义为：化合物2)，其化学式如下：

化合物2为白色无定型粉末，溶于甲醇；HRMS[M-H]-峰m/z1089.551(计算值C53H86O23-为1089.556)，分子式：C53H87O23。

化合物2的分析数据，如图8所示，1H NMR(176MHz，methanol-D4)谱中给出的六个角甲基信号δH 0.72(3H，s)，0.75(3H，s)，0.92(3H，s)，0.97(3H，s)，1.08(3H，s)，1.29(3H，d)，是三萜皂苷类化合物的特征信号，其中H谱化学位移1.29处有裂分为双峰的甲基信号，推测为呋糖或鼠李糖上的甲基信号。H谱信号δH 5.62(1H，d，J＝10.5Hz)，6.47(1H，d，J＝10.5Hz)与图9中的13C NMR(176MHz，methanol-D4)谱中δC 136.2，130.7，125.5，125.4表明化合物具有两个共轭双键结构。图10中，DEPT135谱图给出8个季碳信号，分别对应异环双烯齐墩果烷型三萜皂苷母核上4，8，10，13，14，17，18，20位上8个季碳。根据13C NMR谱中δC106.2，103.8，103.5，103.2与1H NMR谱中的四个糖端基质子信号δH 4.60(1H，d，J＝7.8Hz)，4.54(1H，d，J＝7.7Hz)，4.45(1H，d，J＝7.8Hz)，4.26(1H，d，J＝7.8Hz)可推断化合物2中含有四个糖基结构。根据三萜皂苷类化合物的核磁图谱特征，推断化合物2与化合物1结构相近，同为连有四个糖基的异环双烯型三萜皂苷结构。从端基质子观察到的大的耦合常数(J＝7.7～7.8Hz)可以确定糖链的构型为β构型。16位C化学位移值为δC 76.5，可确定C16-OH为β构型。根据图11-13所示的HSQC，HMBC，1H-1H COSY的二维谱图的综合分析，对化合物2进行了全归属，最终确定化合物2的结构为3-O-β-L-鼠李糖基-(1→2)-[β-D-木糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-(16β,23,29)-三羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。化合物2的1H、13C NMR数据见表1。

实施例5

当R1、R2为H，R3为H，R4为葡萄糖，R5为鼠李糖基-(1→4)-[鼠李糖基-(1→3)-]-葡萄糖基-，该化合物是3-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-[β-L-鼠李糖-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D-葡萄糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-16β-羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷，(在本发明中定义为：化合物3)，其化学式如下：

化合物3为白色无定型粉末，溶于甲醇；HRMS[M+H]+峰m/z1397.692(计算值C66H109O31+为1397.695)，分子式：C67H108O31。

化合物3的分析数据：如图15、16所示，1H NMR(700MHz，methanol-D4)谱中给出的9个角甲基信号δH 0.73(3H，s)，0.75(3H，s)，0.86(3H，s)，0.92(3H，s)，0.94(3H，s)，0.97(3H，s)，1.08(3H，s)，1.26(3H，d)，1.29(3H，d)是三萜皂苷类化合物的特征信号，其中H谱化学位移1.26和1.29处有裂分为双峰的甲基信号，推测为呋糖或鼠李糖上的甲基信号。H谱信号δH 5.60(1H，d，J＝10.5Hz)，6.49(1H，d，J＝10.5Hz)与图17中的13C NMR(176MHz，methanol-D4)谱中δC 136.2，130.7，125.6，125.4表明化合物具有两个共轭双键结构。DEPT135给出8个季碳信号，分别对应异环双烯齐墩果烷型三萜皂苷母核上4，8，10，13，14，17，18，20位上8个季碳。根据13C NMR谱中6个糖端基碳信号δC 105.2，104.3，104.2，103.8，103.5，101.6.与1H NMR谱中的6个糖端基质子信号δH 4.93(1H，d)，4.56(1H，d，J＝7.8Hz)，4.42(1H，d，J＝7.9Hz)，4.37(1H，d，J＝7.9Hz)，4.34(1H，d，J＝7.8Hz)，4.26(1H，d，J＝7.8Hz)可推断化合物3中含有6个糖基结构。根据三萜皂苷类化合物的核磁图谱特征，推断化合物3母核与化合物1，2结构相近，为连有六个糖基的异环双烯型三萜皂苷结构。根据图18-20所示的HSQC，HMBC，1H-1H COSY二维谱图的综合分析，对化合物3进行了全归属，最终确定化合物3的结构为3-O-α-L-鼠李糖基-(1→4)-[β-L-鼠李糖-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-(1→6)-[β-D-葡萄糖基-(1→3)]-β-D-葡萄糖基-11,13(18)-二烯-16β-羟基-28-O-β-D-葡萄糖基-齐墩果烷。化合物3的1H、13CNMR数据见下表1。

表1化合物1-3 1H、13C NMR数据

实施例6

MTS法体外抑激活的肝星状细胞实验

本实施例针对本发明所述的化合物1、2、3进行MTT法体外抑激活的肝星状细胞实验。

肝纤维化的核心是细胞外基质合成与降解的失衡，引起过量细胞外基质病理性积累，肝组织瘢痕化和增厚，而肝星状细胞是细胞外基质的主要来源，且活化肝星状细胞释放出大量的生长因子、细胞趋化因子，进一步加快纤维化进程。所以肝星状细胞的激活是肝纤维化的中心事件，为抗纤维化提供了潜在的治疗靶点。

实验材料：人肝星状细胞株LX-2，大鼠肝星状细胞株HSC-T6。

受试药物：化合物1、2、3，配置终浓度梯度为100μM、50μM、20μM、10μM、5μM、1μM

阳性对照：没食子儿茶素(EGCG)，配置终浓度梯度为100μM、50μM、20μM、10μM、5μM、1μM。

以人肝星状细胞株LX-2为例，采用MTT法测定化合物1-3对激活后肝星状细胞的抑制作用。

实验步骤如下：

(1)将处于对数期的正常状态LX-2细胞制成104个/mL的细胞悬液。

(2)取细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL。37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h，待细胞贴壁。

(3)每孔依次加入TGF-β1至终浓度为10ng/mL孵育24h。

(4)于96孔板中加入受试药物，每组均设6个复孔。同时设立溶剂对照组和EGCG阳性对照组。37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中培养24h。

(5)MTS法测定细胞增殖率，统计数据并进行数据分析。

HSC-T6大鼠肝星状细胞也采用上述的方法经行测试。化合物1-3对激活后的人肝星状细胞株LX-2和鼠肝星状细胞T-6的IC50值见下表2。

表2化合物1-3对细胞LX-2和T-6的IC50值

由表2可见，本发明中的化合物1-3具有显著的抑制激活肝星状细胞的增殖作用，在人肝星状细胞株LX-2，大鼠肝星状细胞株HSC-T6中均显示较低的IC50值，即较强的抑制激活肝星状细胞增殖的作用。并且与阳性对照EGCG具有相近或者更高的抑制细胞增殖的作用。

化合物1、2、3在体外实验中显示较强的抗肝星状细胞增殖的作用，可以作为新的抗肝纤维化药物使用。

实施例7

分子水平的抗肝纤维化活性实验

本实施例针对本发明所述化合物1-3进行分子水平的抗肝纤维化活性实验。

TGF-β1、PDGF是目前所发现的强效促纤维化的细胞因子，能够显著促进肝星状细胞的活化、分裂和增殖，α-SMA是肝星状细胞激活水平的标志蛋白，COL1A1则能反应细胞外基质水平。这些蛋白表达量均与肝纤维化水平成正相关。

采用Elisa试剂盒检测各个样品中蛋白的活性(蛋白试剂盒均由上海鑫乐科技有限公司提供)。试剂盒的使用流程如下：

(1)建立6孔板环境下肝星状细胞LX-2和HSC-T6激活模型并给药(化合物1-3均设置5个浓度梯度：50μM、20μM、10μM、5μM、1μM)。收集细胞培养基上清液和细胞内可溶性蛋白作为待测样品。

(2)准备好ELISA试剂盒，室温平衡20min，计算好所用孔格数。

(3)加样：标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样品蛋白量被稀释5倍)；空白孔不加。

(4)温育：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入HRP标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，放入恒温箱温育60min。

(5)洗涤：按照1(20×洗涤液):20(水)配置洗涤液。到达温育时间后弃去孔内已有的液体，在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(约300μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。

(6)显色：每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

(7)测定：每孔加入终止液50μL以终止反应，并15min内在450nm波长处测定各孔的吸光度值。

表3化合物1-3对于与肝纤维化相关蛋白的IC50值

结果如表3所示，本发明中的化合物1、2、3对于与肝纤维化相关的蛋白：血小板衍生因子(PDGF)、Ⅰ型胶原α1(COL1A1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)均有较低的IC50值，均有较低的IC50值；即具有良好的结合并抑制其生物活性的作用，能够有效抑制肝纤维化。

实施例8

大鼠体内抗肝纤维化实验

本实施例针对本发明所述化合物1、2、3进行大鼠体内抗肝纤维化实验。

实验动物：雄性SD大鼠，SPF级，6-8周龄，体重180+-20，购自中国军事医学科学院实验动物中心，合格证号：SCXK-(军)2012-2004.正常适应性饲养条件：独立隔离饲养笼饲养，温度18-21℃，湿度>40％，150Pa加压送风，循环光照(12h光照，12h黑暗)，自由进水进食(标准颗粒饲料)，隔天换一次垫料和饲料。

(1)实验分组：将实验大鼠60只随机分成6组，分别为正常组(10只)、模型组(10只)、化合物1组(10只)、化合物2组(10只)、化合物3组(10只)、和水飞蓟素组(10只)。

空白组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予生理盐水0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予生理盐水0.1mL/100g，给药4周；

(2)模型组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予生理盐水0.1mL/100g，给药4周；

(3)化合物1组，适应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，化合物3每天以腹腔注射给药，2mg/kg，给药4周；

(4)化合物2组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，化合物2每天以腹腔注射给药，2mg/kg，给药4周；

(5)化合物3组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，化合物3每天以腹腔注射给药，2mg/kg，给药4周；

(6)水飞蓟素组，应性饲养1周结束之后，每周连续3d以腹腔注射的方式每天给予1％DMN，0.1mL/100g，每天以腹腔注射给予水飞蓟素，2mg/kg，给药4周；

(7)大鼠饲养4周后禁食12h，10％水合氯醛以0.35ml/100g腹腔注射麻醉，心脏取血，取出的血静止3-4h后，3500r/min离心10min，取上清，分装后存于-80℃冰箱备用。取血后心脏生理盐水灌流，快速摘取肝脏和脾脏，生理盐水清洗血污，滤纸吸干后分析天平称重，计算肝脏脾脏指数。摘取大鼠肝脏左叶置于中性固定液中，备病理学检测。其余肝脏冻于-80℃，用于后续指标检测。

化合物1-3对大鼠肝纤维化治疗的血清指标的影响结果见表4。

分组ALT(IU/L)AST(IU/L)Alb(g/l)AKP(U/L)正常组29.67±2.9723.51±4.1425.14±2.5131.03±4.98模型组32.81±5.52#30.35±3.50##19.91±1.81##47.44±9.07##化合物1组30.46±4.89*27.40±6.12**22.68±5.33**39.76±6.61**化合物2组29.80±3.45**25.65±5.41**24.03±6.32**36.12±4.29**化合物3组30.46±4.89*29.47±6.12**21.15±3.54**41.59±8.02**水飞蓟素组30.11±2.13*26.58±4.23**24.94±3.40**38.33±5.84**

#P<0.01,##p<0.01与正常组相比。*P<0.05,**p<0.01与模型组相比。

表4化合物1-3对大鼠肝纤维化治疗的血清指标的影响

化合物1-3对大鼠肝纤维化治疗的肝脏指标的影响结果见表5。

#P<0.01,##p<0.01与正常组相比*P<0.05,**p<0.01与模型组相比

表5化合物1-3对大鼠肝纤维化治疗的肝脏指标的影响

从大鼠血清指标和肝脏指标两个方面显示了化合物1、2、3在DMN诱导大鼠肝纤维化模型具有较好的抗肝纤维化药效活性。并且化合物1、2、3具有与阳性对照水飞蓟素等效甚至优于阳性对照的药物活性。化合物1、2、3在体内实验中显示较强的抗肝纤维化的作用，可以作为新的抗肝纤维化药物开发利用。

实施例9

为了从化合物结构及其与蛋白结合机制的层面研究化合物活性，使用分子模拟软件Discovery Studio中CDOCKER模块将3个化合物与关键的促纤维化蛋白TGF-β1和PDGF进行配体与蛋白形成复合物的亲和力表征。表6为化合物与蛋白结合CDOCKER相互作用能量表。CDOCKER相互作用能量可以评估分子与蛋白形成复合物的键亲和力大小，相互作用能量越低，表示结合越容易，亲和性越好。以蛋白在PDB数据库中自带配体作为参考，表明3个化合物均对促纤维化蛋白有较强作用，且强于蛋白自带配体。

表6化合物与蛋白结合CDOCKER相互作用能量表

通过Discovery Studio软件得到3个化合物与蛋白结合模式图如图22-27所示。可知3个化合物在母核和糖链上的羟基或醚键的位置能以范德华力或氢键的方式与强效促纤维化蛋白TGF-β1和PDGF进行结合从而影响其蛋白功能，与实施例6和例7中的结果相一致。从而说明3个新化合物的抗肝纤维化机制与其糖基的位置与糖链的构型有关，目前未发现能够直接作用于TGF-β1和PDGF的三萜皂苷类化合物，而化合物1-3因其结构特点能够作为潜在的TGF-β1和PDGF抑制剂而发挥抗肝纤维化作用。

实施例10

利用MTS法研究了化合物1、2、3和柴胡皂苷D在不同浓度条件下对大鼠正常肝细胞BRL-3A的影响。根据吸光度值计算出BRL-3A在加入不同浓度各药物后的细胞存活率：存活率％＝给药孔OD/对照孔OD×100％。通过Origin Pro 2017进行图形绘制及统计学分析，求得各化合物浓度下的细胞存活率如图28所示。可以看到4个化合物均呈剂量地抑制BRL-3A的存活率。其中柴胡皂苷D作为目前研究发现抗纤维化活性最好的三萜皂苷类化合物，在该实施中作为参照。可以看到柴胡皂苷D对BRL-3A的毒性最大，在浓度为5μM时就出现了显著的对细胞生长的抑制，IC50为15.58±0.94μM。化合物1-3的毒性相对较小，IC50分别为66.42±1.72μM。化合物1-3毒性相对较小，IC50分别为147.24±2.69μM、125.77±1.95μM、151.71±2.58μM。通过与实施例6比较，化合物1-3在对活化的肝星状细胞有较好抑制活性的同时，对正常肝细胞的毒性较小，两者的IC50值相差较大，显示了作为抗肝纤维化药物前体的可能。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

一种三萜皂苷类化合物及其制备方法和应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。