专利摘要

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球、其制备方法及应用。本发明采用溶剂热法制备Fe2O3纳米微球，并以此作为化学模板，将其与K4[Fe(CN)6]复合，再用酸去除残留的Fe2O3，制备得到形貌均一且壳层厚度和内腔尺寸可控的单分散空心普鲁士蓝纳米微球，即为HPBNSs。本发明的制备方法工艺简单，操作方便，成本投入低，所制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球稳定性高、生物相容性好、生物安全性高、装载能力高、光热转换效率高，在药物载体领域具有重要的应用价值。

权利要求

1.一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球，其特征在于，通过以下步骤制备得到：

（1）将FeCl3·6H2O、尿素、柠檬酸三钠、聚丙烯酸钠均匀溶解于去离子水中，在170~200℃条件下反应3~6 h后，冷却至室温，固液分离，将得到的固体经洗涤、干燥，得Fe2O3纳米微球；

（2）将步骤（1）制备的Fe2O3纳米微球分散到醇水混合溶液中，再加入K4[Fe(CN)6]溶液和强酸，在20~30 ℃下超声反应3~8 h，固液分离，将得到的固体经洗涤，干燥，即得Fe2O3@PB复合微球；

（3）将步骤（2）得到的Fe2O3@PB复合微球分散到强酸中，反应6~12 h，固液分离，将得到的固体洗涤、干燥即得单分散空心普鲁士蓝纳米微球；

步骤（1）中FeCl3·6H2O和尿素的质量比为1:1~5:1；FeCl3·6H2O和柠檬酸三钠的质量比为1:2~1:5；FeCl3·6H2O和聚丙烯酸钠的质量比为（1~2）:（80~20）；

步骤（2）中所述醇水混合溶液中醇水比例为（2~3.5）:1；所述K4[Fe(CN)6]与Fe2O3纳米微球的质量比为（0.42~4.2）:1；所加入的强酸的浓度为6~10 M；

步骤（3）中强酸的浓度为1~6 M；Fe2O3@PB复合微球与强酸的固液比为1 g:（300 mL~800mL）。

2.根据权利要求1所述的纳米微球，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）中的强酸为盐酸、硫酸或硝酸中的一种。

3.根据权利要求1所述的纳米微球，其特征在于，所述醇水混合溶液为乙醇与水的混合溶液。

4.权利要求1-3任一所述单分散空心普鲁士蓝纳米微球在用作药物载体中的应用，其特征在于，应用时，将盐酸阿霉素溶解在pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液中，配成浓度为2 mg/mL的溶液，称取5 mg的单分散空心普鲁士蓝纳米微球，加入5 mL 上述溶液，超声条件下混合均匀，在25 ℃下振荡24 h，即得负载盐酸阿霉素的单分散空心普鲁士蓝纳米微球。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球、其制备方法及在用作多功能药物载体中的应用。

背景技术

近年来，生物技术和纳米医学的迅猛发展给肿瘤治疗带来一场全新的变革。其中，基于纳米材料的新型药物载体为肿瘤治疗提供了新的思路。当前制备新型药物载体的纳米材料主要有：脂质体、高分子材料、聚合物胶束和无机纳米材料等。这些新型药物载体具有改变药物代谢动力学、提高载药量和药物利用率、实现药物的靶向运输和病灶部位的按需给药、调节药物释放速率等优异性能，对肿瘤的高效治疗和减少机体毒副作用有着重要的意义，受到了国内外研究者的广泛关注，成为纳米生物医学领域重点研究方向之一。

中空微球是一种特殊的结构，它内部的空腔可装载大量的药物分子，介孔壳层可作为药物装载和释放的通道，因而在纳米药物载体领域具有广阔的应用前景。该结构最大的优点是比表面积大，可通过调节壳层厚度、孔径大小和孔形貌等方式改善药物的装载率及缓释性能。

为了提高肿瘤患者生存质量，近年来无创/微创肿瘤治疗新技术研究成为国内外备受关注的研究课题。其中，基于纳米载体的新型光热治疗方式，将具有近红外光热转换能力的纳米材料在肿瘤部位实现选择性累积，同时其能够在实施近红外光照的条件下高效地将光能转化为热能，使肿瘤产生局部超高温度，从而轻易将肿瘤热消融，但对于正常的组织和器官没有损伤。随着纳米医学和生物技术的迅猛发展，研究者们致力于开发出具有更高光热转换效率、更高生物安全性、更低毒性的光热转换剂。

研究发现单一的光热治疗产生的热分布不均可能导致肿瘤热消融不完全，从而导致肿瘤的复发和转移等相关问题。为了更加有效地发挥近红外光热治疗在肿瘤治疗中的优势，研究者将近红外光热治疗和化学药物治疗相结合协同治疗，可极大地提高肿瘤治疗效率。

因此，设计一种形貌可控、稳定性高、生物相容性好、生物安全性高、装载能力高、光热转换效率高的载体材料在肿瘤治疗等重大疾病领域将具有非常重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便的方法设计制备出稳定性高、生物相容性好、生物安全性高、装载能力高、光热转换效率高的单分散空心普鲁士蓝纳米微球。

本发明还提供了上述单分散空心普鲁士蓝纳米微球的制备方法。

本发明进一步又提供了上述单分散空心普鲁士蓝纳米微球在用作多功能药物载体中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将FeCl3·6H2O、尿素、柠檬酸三钠均匀溶解于去离子水中，然后加入聚丙烯酸钠（分子量为20000~2000000，室温下凝胶状），搅拌均匀后转移到高压反应釜中，在170~200℃条件下水热反应3~6 h后，冷却至室温，固液分离，得到橙黄色固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55~65 ℃干燥，得Fe2O3纳米微球；

（2）将步骤（1）制备的Fe2O3纳米微球分散到醇水混合溶液中，然后加入K4[Fe(CN)6]（亚铁氰化钾）溶液，机械搅拌，待充分混合均匀后，加入强酸，在20~30 ℃下超声反应3~8 h，固液分离，得到固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55~65 ℃下干燥，即得Fe2O3@PB复合微球；所述PB为普鲁士蓝（亚铁氰化铁），其化学式为Fe4[Fe(CN)6]3；

（3）将步骤（2）得到的Fe2O3@PB复合微球分散到强酸中，摇床振荡反应6~12 h后，固液分离，将得到的固体依次用乙醇、去离子水洗涤后，在55~65 ℃下干燥即得单分散空心普鲁士蓝纳米微球。

具体的，步骤（2）和步骤（3）中的强酸为盐酸、硫酸或硝酸中的一种。

具体的，步骤（1）中FeCl3·6H2O和尿素的质量比为1:1~5:1；FeCl3·6H2O和柠檬酸三钠的质量比为1:2~1:5；FeCl3·6H2O和聚丙烯酸钠的质量比为（1~2）:（80~20）。

具体的，步骤（2）中醇水混合溶液，优选采用乙醇与水混合，其中醇水比例为（2~3.5）:1，总体积为45 mL。

具体的，步骤（2）中K4[Fe(CN)6]与Fe2O3纳米微球的质量比为（0.42~4.2）:1；所加入的K4[Fe(CN)6]溶液的浓度为0.1 M，体积为0.1 mL~1.0 mL；所加入的强酸的浓度为6~10M，体积为4~6 mL。

具体的，步骤（2）中机械搅拌速度为200~400 r/min。

具体的，步骤（3）中强酸的浓度为1~6 M，体积为4~10 mL；Fe2O3@PB复合微球与强酸的固液比为1 g:（300 mL~800 mL）。

上述制备方法通过以Fe2O3纳米微球作为化学模板，将K4[Fe(CN)6]与Fe2O3复合，再用酸去除Fe2O3，制备得到单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs。

所述单分散空心普鲁士蓝纳米微球在用作药物载体中的应用，尤其是在用作多功能药物载体中的应用。

本发明产生的有益效果是：

1、本发明首先采用溶剂热法制备Fe2O3纳米微球，并以此作为化学模板，利用Fe2O3在酸性溶液中缓慢释放Fe3+以提供Fe3+源，同时巧妙地引入乙醇抑制HCl的电离，并同时抑制K4[Fe(CN)6]的电离，有效控制反应速率，在温和的条件下制备出单分散的Fe2O3@PB复合微球，该过程采用超声和机械搅拌辅助合成，保障了复合微球的高度分散性，并通过后续溶解残留的Fe2O3核，进而制备出形貌均一且壳层厚度和内腔尺寸可控的单分散空心普鲁士蓝纳米微球。

2、所制得的单分散空心普鲁士蓝纳米微球比表面积为302.9 m2/g，以盐酸阿霉素（DOX）为药物模型，实现对其载药释药的性能研究。实验结果表明载药量高达440 mg/g，在pH为5.0的PBS缓冲溶液中48 h内药物的释放率最高达到61.1%，表现出良好的药物缓释性能；光热实验表明，对于浓度为200 μg/mL的溶液体系，采用808 nm功率密度为1W/cm2的红外光照射5分钟，温度可升至75.9 ℃，表现出优异的光热转换效率和光热稳定性；以Hela细胞为研究对象，该PB空心微球具有很好的生物安全性，且采用浓度为50 μg/mL的剂量，通过光热和药物协同杀死肿瘤细胞效率达60%。

3、采用808 nm激光照射制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs，其可以将光能转换成热能，同时有效消融肿瘤；其内部可以装载抗癌药物，在使用过程中可以体现热疗和化疗二者协同的效果，极大提高肿瘤杀死效率。

附图说明

图1为实施例1制备得到的Fe2O3纳米微球的扫描电子显微镜照片；

图2为实施例1制备得到的Fe2O3@PB复合微球透射电子显微镜照片；

图3为实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球透射电子显微镜照片；

图4为实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的XRD图；

图5为实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的IR图；

图6为实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的紫外-可见-近红外吸收图；

图7为实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的氮气吸附脱附曲线和孔径分布图；

图8为载药前后实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的紫外-可见-近红外吸收光谱图；

图9为载药后实施例1单分散空心普鲁士蓝纳米微球的傅里叶红外光谱图；

图10为实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球在pH为5.0的PBS缓冲溶液中48 h内药物的释放曲线图；

图11为实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球在pH为5.0的PBS缓冲溶液中激光控制药物的释放曲线图；

图12为实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球不同浓度的红外热成像图；

图13为实施例1制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs样品进行5次激光循环照射图；

图14为激光照射前后实施例1制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs样品的TEM图和紫外-可见-近红外吸收图谱；

图15为不同浓度样品的细胞存活率图；

图16为孵育含有HPB-DOX NSs的Hela细胞的共聚焦显微镜检测图；

图17为HPB-DOX NSs体外化疗抗肿瘤效果的细胞存活率图；

图18为HPB NSs体外光热抗肿瘤效果的细胞存活率图；

图19为HPB NSs体外光热治疗效果的共聚焦显微镜检测图；

图20为实施例2制备得到的Fe2O3@PB复合微球透射电子显微镜照片；

图21为实施例2制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球透射电子显微镜照片；

图22为实施例3制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球透射电子显微镜照片。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。

实施例1

一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将1 g FeCl3·6H2O、1 g尿素、3 g柠檬酸钠均匀溶解于60 g去离子水中，然后加入80 g聚丙烯酸钠（分子量为20000~2000000，室温下凝胶状），搅拌均匀后转移到反应釜中，在180 ℃条件下水热反应3 h，冷却至室温，离心分离，得到橙黄色固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在60 ℃干燥，得Fe2O3纳米微球；

（2）将10 mg步骤（1）制备的Fe2O3纳米微球分散到45 mL醇水混合溶液（乙醇35 mL，水10 mL）中，然后加入0.1 mL浓度为0.1 M的K4[Fe(CN)6]溶液，以200 r/min的转速进行机械搅拌，待充分混合均匀后，采用蠕动泵滴加的方式加入5 mL 6 M的HCl，25 ℃下超声反应4 h，离心分离，得到固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55 ℃下干燥即制得Fe2O3@PB复合微球；

（3）将步骤（2）得到的20 mg Fe2O3@PB复合微球分散到体积为6 mL，浓度为3 M的HCl中，摇床振荡反应8 h，离心分离，将得到的固体依次用乙醇、去离子水洗涤后，在55 ℃下干燥即制得单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs。

实施例1制备的Fe2O3纳米微球的透射电子显微镜照片如图1所示，从图1可以看出，Fe2O3纳米微球排列规整，具有良好的单分散性；实施例1制备得到的Fe2O3@PB复合微球的透射电子显微镜照片如图2所示，从图2可以看出，PB（普鲁士蓝）成功的包覆在Fe2O3纳米微球表面，厚度约为25 nm，且包覆过PB壳层后仍保持良好的单分散性；实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球在不同放大倍数下的透射电子显微镜照片如图3所示，从图3可以看出，Fe2O3@PB复合微球经过3 M盐酸的腐蚀，剩余的Fe2O3核被完全刻蚀掉，形成空心结构PB纳米微球，同时PB壳层仍保持其完整性；实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球的XRD和红外光谱图如图4和5所示，从图中可以看出，成功制备出单分散空心普鲁士蓝；实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球的紫外-可见-近红外吸收图如图6所示，从图中可以，单分散空心普鲁士蓝的吸收峰在500~900 nm之间；实施例1制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球，采用BET法测定的N2吸附-脱附曲线和孔径分布图如图7所示，实验结果表明单分散空心普鲁士蓝的比表面积为302.9 m2/g，孔径大小集中分布在3.8 nm左右。

药物缓控释性能测试：

（1）药物载入试验

以pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）为溶剂，将盐酸阿霉素（DOX）溶解在PBS中，配成一定浓度的溶液（2 mg/mL），记为DOX-PBS。称取5 mg的实施例1制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs样品，加入5 mL DOX-PBS溶液，超声使其充分混合均匀，避光放入摇床，在25 ℃下振荡24 h，使样品充分负载药物，此过程中，由于单分散空心普鲁士蓝纳米微球自身带负电，而DOX带正电荷，两者之间存在静电相互作用，因此DOX可以负载在纳米微球上，同时，单分散空心普鲁士蓝纳米微球结构中固有的Fe（III）与DOX上氨基和羰基也存在配位作用，促进了负载吸附效果。负载后将样品离心洗涤，用紫外分光光度计检测上清液在480nm处的吸光度，用差减法计算单位质量中空微球的载药量，实验结果表明载药量高达440mg/g。

载药量Qe = 载上的DOX的质量/载体样品的质量，可按下面公式计算：

C0 ：药物起始浓度（mg/mL）；

Ce ：载药后药物的浓度（mg/mL）；

V ：药物溶液的体积（mL）；

M ：载体质量（g）。

为了进一步证明成功将DOX载入到实施例1制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs样品中，对载药前后的溶液进行紫外-可见-近红外吸收光谱表征，如图8所示，载药后的溶液的吸光度远小于载药前的溶液，证明成功将DOX载入到HPB NSs中；此外，图8从左到右依次为载药前DOX溶液，载药后HPB-DOX NSs混合溶液和载药后上清液，从溶液颜色变化也能直观的看出成功载入DOX。同时，对DOX、HPB NSs、HPB-DOX NSs进行傅里叶红外光谱表征，如图9所示，HPB-DOX NSs的傅里叶红外光谱图在1215 cm-1，1285 cm-1，1408 cm-1出现典型的DOX基团峰，也证明成功将DOX载入进去。

（2）药物释放

用pH=5.0的磷酸盐缓冲溶液（PBS）来模拟肿瘤微环境进行药物体外释放的研究。将载有DOX药物的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs放入透析袋中，并浸入到25 mL的PBS溶液中，放到37 ℃的恒温振荡器中振荡，分别在0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24h和48 h时间点取5 mL DOX释放缓冲溶液，然后立即补充5 mL新配的缓冲溶液继续振荡。对于激光照射控制药物释放组，选取808 nm功率密度为1 W/cm2的激光在0 min、60 min和120min时间点照射10 min，随后取出5 mL DOX释放缓冲溶液，并立即补充相同体积新配的缓冲溶液，在摇床中继续振荡。利用紫外-可见-近红外分光光度计测试各个时间点取出的缓冲溶液在480 nm处的吸光度，并根据DOX标准曲线计算各个时间点的DOX释放量，进而得到累计释放率。计算公式如下：

（i=1）

（i≥2）

Er：药物的累计释放百分数(%)；

Ve ：释放介质的替换体积；

V0 ：释放体系中释放液(PBS)的体积；

Ci ：第i次取液时外界释放液中药物的浓度(μg/mL)；

mdrug：纳米粒子中药物的总质量。

由图10可知，在pH为5.0的PBS缓冲溶液中48 h内药物的累积释放率达到61.1%，表现出良好的pH响应药物释放性能。如图11所示，利用激光也可以控制药物释放，测试结果显示，在180 min内，其累积释放率达到52.3%。

光热性能测试：

将单分散空心普鲁士蓝纳米微球用去离子水配置一系列浓度（0、10、25、50、100、200 μg/mL），在恒温25 ℃环境中，选取808 nm激光（功率密度为1W/cm2）照射5 min，期间用红外热感相机持续拍摄，每30 s记录一下温度，同时拍照一次。如图12所示，当浓度为100 μg/mL，升温达到70 ℃以上，表现出良好的光热转换性能。

为了进一步研究样品的光热稳定性，同时对浓度为200 μg/mL的实施例1制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs样品进行5次激光循环照射，如图13所示，上升的最高温度基本一致，实验结果表明实施例1制备的HPB NSs具有良好的光热稳定性；同时对比激光照射前后样品的TEM图和紫外-可见-近红外吸收图谱，如图14所示，激光照射前后样品的近红外吸收谱带位置基本不变，并且照射前后的形貌也并未改变（左上未照激光，右下照激光），实验结果同样表明HPB NSs具有极佳的光热稳定性，为后续肿瘤光热治疗奠定了基础。

细胞毒性试验：

纳米材料的生物安全性对于其是否能够临床应用至关重要。为了考察实施例1制备的HPB NSs对宫颈癌（Hela）细胞的生物毒性，本研究采用生物领域常用的MTT方法，如图15所示，为不同浓度样品的细胞存活率。研究结果显示，随着样品浓度的增加，细胞存活率略微下降，当浓度高达200 μg/mL时，Hela细胞的存活率仍然高达91.1%，实验结果表明HPBNSs具有良好的生物安全性。

细胞内吞实验：

为了研究纳米材料是否进入到肿瘤细胞内部，用共聚焦显微镜检测孵育含有HPB-DOX NSs的Hela细胞，如图16所示，蓝色荧光是使用Hoechst染色，染细胞核，红色荧光在细胞质内分布，由DOX本身产生，从Merge图中可以清楚地看到DOX分布在肿瘤细胞内，实验结果表明，纳米材料成功被肿瘤细胞内吞，并且DOX在肿瘤细胞内大量释放。

抗肿瘤试验：

（1）体外化疗抗肿瘤实验

为了研究HPB-DOX NSs体外化疗抗肿瘤效果，设置样品浓度依次为0、10、25、50 μg/mL和100 μg/mL，如图17所示，当浓度为50 μg/mL，细胞杀死效率达到23.6%；当浓度为100μg/mL，细胞杀死效率达到31.2%，实验结果表明HPB-DOX NSs的化疗对细胞具有一定的杀伤效果。

（2）体外热疗抗肿瘤实验

为了研究HPB NSs体外光热抗肿瘤效果，设置样品浓度依次为0、10、25、50和100 μg/mL，采用波长为808 nm，功率为1 W的激光器照射5 min，如图18所示，当样品浓度为50 μg/mL，细胞杀死效率达到44.4%；当样品浓度增加到100 μg/mL，细胞杀死效率达到86.8%，实验结果表明HPB NSs的光热治疗对细胞具有很大的杀伤效果。

为了进一步探索HPB NSs光热治疗效果，用共聚焦显微镜检测不同处理组的Hela细胞，如图19所示，从荧光图中可以看出，单独NIR照射组和单独加药组基本没有细胞凋亡，其中绿色荧光为Calcein-AM染色（活细胞），红色荧光为PI染色（死细胞）；浓度为50 μg/mL时，HPB NSs +激光照射组的实验结果表明低浓度的样品产生的光热对细胞具有一定的杀死效率；当浓度升高到100 μg/mL时，HPB NSs +激光照射组实验结果表明，适当浓度产生的光热能力可以极大地杀死癌细胞。上述实验结果证明了HPB NSs具有良好的光热效果，可以有效杀死癌细胞。

实施例2

一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将1 g FeCl3·6H2O、0.5 g尿素、2 g柠檬酸三钠均匀溶解于60 g去离子水中，然后加入30 g聚丙烯酸钠，搅拌均匀后转移到反应釜中，在170 ℃条件下水热反应3 h，冷却至室温，离心分离，得到橙黄色固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55 ℃干燥，得Fe2O3纳米微球；

（2）将10 mg步骤（1）制备的Fe2O3纳米微球分散到45 mL醇水混合溶液（乙醇35 mL，水10 mL）中，然后加入0.1 mL浓度为0.1 M的K4[Fe(CN)6]溶液，以200 r/min的转速进行机械搅拌，待充分混合均匀后，采用蠕动泵滴加的方式加入4 mL 6 M的HCl，25 ℃下超声反应3 h，离心分离，得到固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55 ℃下干燥即制得Fe2O3@PB复合微球；

（3）将步骤（2）得到的20 mg Fe2O3@PB复合微球分散到体积为4 mL，浓度为3 M的盐酸中，摇床振荡反应6 h，离心分离，将得到的固体依次用乙醇、去离子水洗涤后，在55 ℃下干燥即制得单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs。

图20为实施例2制备得到的Fe2O3@PB复合微球透射电子显微镜照片，图21为实施例2制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球透射电子显微镜照片。

实施例3

一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）将1 g FeCl3·6H2O、0.25 g尿素、4 g柠檬酸三钠均匀溶解于30 g去离子水中，然后加入40 g聚丙烯酸钠，搅拌均匀后转移到反应釜中，在190 ℃条件下水热反应3 h，冷却至室温后，离心分离，得到橙黄色固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55 ℃干燥，得Fe2O3纳米微球；

（2）将10 mg步骤（1）制备的Fe2O3纳米微球分散到45 mL醇水混合溶液（乙醇35 mL，水10 mL）中，然后加入0.2 mL浓度为0.1 M的K4[Fe(CN)6]溶液，以200 r/min的转速进行机械搅拌，待充分混合均匀后，采用蠕动泵滴加的方式加入5 mL 8 M的HCl，25 ℃下超声反应5 h，离心分离，得到固体，并依次用乙醇、去离子水洗涤，然后在55 ℃下干燥即制得Fe2O3@PB复合微球；

（3）将步骤（2）得到的20 mg Fe2O3@PB复合微球分散到体积为4 mL，浓度为4 M的盐酸中，摇床振荡反应10 h，离心分离，将得到的固体依次用乙醇、去离子水洗涤后，在55 ℃下干燥即制得单分散空心普鲁士蓝纳米微球HPB NSs。

图22为实施例3制备得到的单分散空心普鲁士蓝纳米微球透射电子显微镜照片，本发明可以通过控制反应时间来控制复合微球的壳层厚度，调控模板尺寸来控制内腔尺寸，从而控制单分散空心普鲁士蓝纳米微球的结构和形貌。

实施例2-3所制备的单分散空心普鲁士蓝纳米微球，其性能等与实施例1所得产品相当。

上述实施例为本发明实施方式的举例说明，尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它任何未背离本发明精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

一种单分散空心普鲁士蓝纳米微球、其制备方法及应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。