专利摘要

本发明涉及拟人参皂苷12‑酮‑PF11及提取方法及其医药用途，属医药领域。取西洋参花蕾适量，加3～5倍量的80～95％乙醇加热回流提取，每次2～4小时，共提取3～5次，提取液回收溶剂至干后，依次以大孔吸附树脂、硅胶柱层析、C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，甲醇等有机溶剂重结晶得到拟人参皂苷12‑酮‑PF11。本发明进行了动物模型实验，能降低小鼠过敏性休克的死亡率，减轻迟发型超敏反应小鼠耳肿胀度，并抑制5‑羟色胺和组胺导致的小鼠毛细血管通透性增加。本发明的拟人参皂苷12‑酮‑PF11作为药物活性成分，有望开发成为用于预防和治疗过敏性疾病的新型药物，为过敏性疾病的预防和治疗提供临床指导与依据，进而减轻患者痛苦，改善患者生活质量。

权利要求

1.一种拟人参皂苷12-酮-PF11，其特征在于如下式所示：

分子量：798.5

化学名：6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-12-酮-20S，24R-环氧-3β，6α，25-三醇；

分子式：C42H70O14

白色粉末，易溶于甲醇、吡啶，TLC检测，10％H2SO4乙醇溶液为显色剂，105℃加热呈紫色。

2.如权利要求1所述的拟人参皂苷12-酮-PF11的提取方法，其特征在于步骤如下：

取干燥的西洋参花蕾，粉碎，加3～5倍量的80～95％乙醇加热回流提取，每次2～4小时，共提取3～5次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101或者AB-8大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加30～45％乙醇洗脱，再加70～85％乙醇洗脱，收集70～85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2～3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇或二氯甲烷或三氯甲烷：乙酸乙酯或乙醇或甲醇：水＝(5～20)：(1～5)：(1～5)，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为甲醇或乙腈：水＝(25～75)：(25～75)，减压回收至干，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯或者乙腈重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

3.根据权利要求2所述的拟人参皂苷12-酮-PF11的提取方法，其特征在于步骤如下：

取干燥的西洋参花蕾，粉碎，加3倍量的80％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加45％乙醇洗脱，再加70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2次400目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇：乙酸乙酯：水＝10:2:3，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝50:50，减压回收至干，采用乙醇重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

4.如权利要求1所述的拟人参皂苷12-酮-PF11在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及拟人参皂苷12-酮-PF11及其提取方法及其在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用。

背景技术

过敏性疾病，是一种机体接触外界过敏原后引起的I型变态反应性疾病，又称为速发型或过敏型变态反应性疾病。临床上过敏性疾病包括荨麻疹、湿疹、特征性皮炎、过敏性哮喘、过敏性鼻炎等多种疾病。随着社会发展，工业化进程的加快以及人们生活方式的改变，过敏性疾病患病率不断提升，过敏性疾病严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗过敏性疾病常用的药物是抗组胺药、皮质类固醇激素和免疫抑制剂等。但是上述治疗存在如下问题：药效时间短、价格昂贵且周期长，长期使用皮质类固醇激素和免疫抑制剂有加重微血管损伤、患皮质类固醇征和破坏机体的免疫系统等副作用。因此需加强治疗该病的药物研究，寻找有效的治疗方法有重大意义。

现代药理研究表明五加科植物人参及其皂苷和多糖成分对过敏性疾病有治疗作用：红参能减少小鼠特征性皮炎过敏引起的抓挠，减轻特征性皮炎样皮损症状，并能缓解过敏性鼻炎；人参皂苷Rh2和Rd能减轻Compound48/80和IgE引起的过敏反应；人参皂苷Rg3，Rf和Rg5能抑制IgE诱导的被动皮肤过敏反应；人参皂苷Rg5和Rh3能缓解慢性皮炎的症状；人参皂苷Rh2和Rh1能减轻小鼠哮喘模型的气道炎症反应，对哮喘有治疗作用；人参皂苷Rh1能通过作用于肥大细胞从而抑制大鼠过敏反应，同时抗Ig-E诱导的小鼠被动皮肤超敏反应；人参多糖Ginsan减少小鼠哮喘反应的发生；西洋参根多糖提取物专利产品CVT-E002 临床上能够减轻人体气道病毒感染，实验研究表明能减轻小鼠的过敏反应。以上用于治疗过敏性疾病的研究结果表明五加科植物中的人参皂苷和多糖等成分在治疗过敏性疾病方面具有潜在作用。

西洋参(Panax quinquefolius L.)是五加科人参属多年生草木植物，原产于加拿大与美国，现在我国长白山等地也有种植。西洋参花蕾是西洋参植物营养成分的中药储存器官，活性成分皂苷等的含量高于其他生长部位(根、茎叶、果)。除上述西洋参根多糖提取物CVT-E002 外，西洋参在过敏性疾病中的研究鲜有报道，对西洋参中特有的奥克梯隆型皂苷在过敏性疾病的研究处于空白。

发明内容

本发明提供一种拟人参皂苷12-酮-PF11及提取方法及其医药用途，该医药用途为制备治疗过敏性疾病的药物中的应用。

本发明采取的技术方案是，一种如下式的拟人参皂苷12-酮-PF11：

分子量：798.5

化学名：6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-12-酮-20S，24R-环氧-3β，6α，25-三醇；

分子式：C42H70O14

白色粉末，易溶于甲醇、吡啶。TLC检测，10％H2SO4乙醇溶液为显色剂，105℃加热呈紫色。

本发明拟人参皂苷12-酮-PF11的提取方法是：

取干燥的西洋参花蕾，粉碎，加3～5倍量的80～95％乙醇加热回流提取，每次2～4小时，共提取3～5次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101或者AB-8大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加30～45％乙醇洗脱，再加70～85％乙醇洗脱，收集70～85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2～3次200-400目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇或二氯甲烷或三氯甲烷：乙酸乙酯或乙醇或甲醇：水＝(5～20)：(1～5)；(1～5)，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为甲醇或乙腈：水＝(25～75):(25～75)，减压回收至干，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯或者乙腈重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

优选为：

取干燥的西洋参花蕾，粉碎，加3倍量的80％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加45％乙醇洗脱，再加70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2次400目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇：乙酸乙酯：水＝10:2:3，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝50:50，减压回收至干，采用乙醇重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

本发明拟人参皂苷12-酮-PF11在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。

本发明用于制备治疗过敏性疾病的药物时，其口服给药或胃肠外给药均是安全的。在口服情况下，其可以是任何常规形式给药，如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸、软胶囊、漂浮剂、口服液、悬浮液、糖浆、口腔含片、喷雾剂或气雾剂等；当该药物肠胃外给药时，可采取任何常规形式，例如注射剂：如静脉内注射、软膏剂、栓剂、经皮给药、吸入剂等。

本发明制备治疗过敏性疾病的药物时是由有效成分单体或有效成分与固体或液体的赋形剂一起构成的，这里使用的固体或液体赋形剂在本领域是众所周知的，下面举几个具体例子，固体制剂的赋形剂有乳糖、淀粉、浆糊精、碳酸钙、合成或天然硫酸铝、氯化镁、硬脂酸镁,碳酸氢钠、干燥酵母等液体制剂的赋形剂有水、甘油、丙二醇、单糖浆、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇等软膏剂的赋形剂可以使用脂油，含水羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蜡、木腊、液体石蜡、树脂、高级蜡等组合成的疏水剂或亲水剂。

本发明的有益效果在于，新化合物拟人参皂苷12-酮-PF11，首次分离得到，并用于治疗过敏性疾病，可用于制备治疗过敏性疾病的药物，具有疗效显著的特点。有效物质的剂量可以根据服用方式，病人的年龄和体重及病情严重程度和其它类似的因素而改变。

附图说明

图1是本发明化合物的1H NMR谱图；

图2是本发明化合物的13C NMR谱图；

图3是本发明化合物的HSQC谱图；

图4是本发明化合物的HMBC谱图；

图5是本发明化合物的1H-1H COSY谱图；

图6是本发明化合物的MS谱图；

图7拟人参皂苷12-酮-PF11对小鼠过敏性休克模型生存率的影响。

具体实施方式

实施例1

取干燥的西洋参花蕾10kg，粉碎，加4倍量的85％乙醇加热回流提取，每次3小时，共提取4次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于AB-8大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加40％乙醇洗脱，再加75％乙醇洗脱，收集75％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2次200目硅胶柱层析，洗脱剂：三氯甲烷：甲醇：水＝10：3；1，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为乙腈：水＝40：60，减压回收至干，采用乙酸乙酯重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11；

采用波谱学方法进行结构鉴定：

化合物1

HR-ESI-MS谱给出分子量为799.4841[M+H]+(计算值为799.4844，C42H71O14)的准分子离子峰，结合1H NMR、13C NMR谱确定分子式为C42H70O14。Libermann-Burchard呈阳性，TLC检测10％H2SO4乙醇溶液为显色剂，105℃加热呈紫色，提示为人参皂苷类化合物；该化合物酸水解产物进行气相质谱分析，采用标准品比对分析确证，所连有糖基为D-葡萄糖和L-鼠李糖；

1H NMR(600MHz,pyridine-d5)：高场给出9个甲基信号：δ0.85(3H,s),0.99(3H,s),1.21(3H,s),1.36(3H,s),1.37(3H,s),1.40(3H,s),1.42(3H,s),2.10(3H,s),1.87(3H,d,J＝6.2Hz)；未给烯氢质子信号；中场给出β-D-葡萄糖和α-L-鼠李糖的两个端基质子信号：δ5.29(1H,d,J＝6.9Hz),6.49(1H,s)；H-6位质子信号出现在δ4.76(1H,m)，表明6位有-OH取代，提示可能为三醇型人参皂苷；与拟人参皂苷F11比较，该化合物的氢谱未给出H-12的质子信号，且H-11和H-13的质子化学位移偏向低场：δ2.33(2H,m,H-11)，3.10(1H,m,H-13)，提示12位可能为羰基；1H NMR谱中还给出其他质子信号；

13C NMR(150MHz,pyridine-d5)：共给出48个碳信号；C-7和C-8化学位移分别为δ45.6，42.0，验证了该化合物为三醇型人参皂苷元的推断；与20S原人参三醇型皂苷比较，该化合物中C-16位向高场位移约1ppm至δ25.6，同时δ85.8(C-20)和85.1(C-24)两个连氧碳信号提示C-17侧链呋喃环的存在，提示该化合物为奥克梯隆型人参皂苷；该化合物A、B、D环，17位的侧链以及两个糖的化学位移与文献报道的拟人参皂苷F11基本一致，但是出现了羰基碳δ210.8(C-12)的信号，且C环上9，10，11，13，14位碳的化学位移偏向低场：δ54.2，40.0，40.5，57.3，56.1，表明12位为羰基；HMBC谱给出以下证明12位羰基存在的质子与碳信号的主要相关：H-11/C-12；H-13/C-12,C-14,C-17,C-20,C-30；H-15/C-17；H-21/C-17,C-20,C-22；H-24/C-26；H-26/C-25,C-27；H-27/C-25,C-24；H-1′/C-6,C-2'；H-1″/C-2',C-2”。根据HSQC、HMBC和1H-1H COSY谱图，对该化合物的碳氢信号进行全归属，数据见表1。

综合分析，鉴定该化合物为6-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃葡萄糖基]-达玛-12-酮-20S，24R-环氧-3β，6α，25-三醇。经SciFinder检索未发现有关该化合物的文献报道，为一新化合物，命名为拟人参皂苷12-酮-PF11。

该化合物的1H NMR谱、13C NMR谱、HSQC谱、HMBC谱、1H-1H COSY谱图、MS谱图分别见附图1-6。

表1拟人参皂苷12-酮-PF11的NMR数据和HMBC相关

1H NMR(600MHz,pyridine-d5)；13C NMR(150MHz,pyridine-d5)

实施例2

取干燥的西洋参花蕾20kg，粉碎，加3倍量的80乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取5次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加30％乙醇洗脱，再加70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2次200目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇：乙酸乙酯：水＝5：1；3，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝25:75，减压回收至干，采用乙醇结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

实施例3

取干燥的西洋参花蕾5kg，粉碎，加5倍量的95％乙醇加热回流提取，每次2小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加45％乙醇洗脱，再加85％乙醇洗脱，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行3次400目硅胶柱层析，洗脱剂：二氯甲烷：乙醇：水＝20：5；5，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶开放柱或者中压制备柱分离，洗脱液为乙腈：水＝75:25，减压回收至干，采用甲醇重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

实施例4

取干燥的西洋参花蕾3kg，粉碎，加3倍量的80％乙醇加热回流提取，每次4小时，共提取3次，合并提取液，回收溶剂至干，以水使之混悬，加于D-101大孔吸附树脂中，先以水冲洗，再加45％乙醇洗脱，再加70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收溶剂至干，再进行2次400目硅胶柱层析，洗脱剂：正丁醇：乙酸乙酯：水＝10:2:3，洗脱液减压浓缩回收至干，进行C18反相硅胶中压制备柱分离，洗脱液为甲醇：水＝50:50，减压回收至干，采用乙醇重结晶得拟人参皂苷12-酮-PF11。

下边通过药效学试验例进一步说明本发明的效果。

试验例1：拟人参皂苷12-酮-PF11对Compound48/80所致小鼠过敏性休克的影响。

采用Compound48/80对BALB/c小鼠建立I型超敏反应性休克模型。BALB/c小鼠60只，雌雄各半，随机分为正常组、模型组、阳性药扑尔敏组(4mg/kg)拟人参皂苷12-酮-PF11低、中、高剂量组(10mg/kg；20mg/kg；40mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积生理盐水，阳性药和拟人参皂苷12-酮-PF11各剂量组分别灌胃给药，每日一次，连续给药7天。末次药l h后腹腔注射Compound48/80(10mg/kg),并观察腹腔注射后15、30、45、60min内小鼠的死亡情况，记录生存率。

结果：如图7、表2所示，10mg/kg的Compound48/80可导致小鼠休克，死亡(与正常组比较差异具有统计学意义具有显著性差异，###P<0.001)；给予拟人参皂苷12-酮-PF11能呈剂量依赖性地降低小鼠休克反应的死亡数，提高生存率；给药拟人参皂苷12-酮-PF11高剂量抗过敏性休克效果最好，抗过敏休克作用与阳性药扑尔敏相当，拟人参皂苷12-酮-PF11高剂量组死亡数与模型组比较差异显著(差异具有统计学意义，*P<0.05)。

表2拟人参皂苷12-酮-PF11对Compound48/80所致小鼠过敏性休克的影响

结论：拟人参皂苷12-酮-PF11能降低Compound48/80所致小鼠过敏性休克的死亡率，提高生存率。

试验例2：拟人参皂苷12-酮-PF11对迟发型超敏反应小鼠模型耳肿胀的影响。

采用二硝基氯苯(DNCB)法对BALB/c小鼠建立迟发型超敏反应模型。BALB/c小鼠50只，雌雄各半，随机分为模型组、阳性药扑尔敏组(4mg/kg)、拟人参皂苷12-酮-PF11低、中、高剂量组(10mg/kg；20mg/kg；40mg/kg)。模型组灌胃给予等体积生理盐水，阳性药和拟人参皂苷12-酮-PF11各剂量组分别灌胃给药，每日一次，连续给药7天。造模方法：实验第1天在小鼠背部皮下注射50μL 2％的DNCB溶液，第6天在小鼠左耳耳廓两面均匀涂抹20μL 2％的DNCB溶液，24h后脱颈椎处死小鼠，用打孔器(8mm)在小鼠左右两耳同一部位打下耳片并称重，以左右耳片差作为肿胀度，并计算肿胀抑制率。

结果：如表3所示，DNCB造模的小鼠耳部发生肿胀，成功建立迟发型超敏反应模型；给药拟人参皂苷12-酮-PF11能呈剂量依赖性地减轻小鼠耳肿胀度；给药拟人参皂苷12-酮-PF11高剂量抗迟发型超敏反应效果最好(与模型组比较具有显著性差异差异具有统计学意义，*P<0.05)。

表3拟人参皂苷12-酮-PF11对迟发型超敏反应小鼠模型耳肿胀的影响

结论：拟人参皂苷12-酮-PF11能减轻迟发型超敏反应小鼠耳肿胀度。

试验例3：拟人参皂苷12-酮-PF11对5-羟色胺导致的小鼠毛细血管通透性增加的影响。

采用5-羟色胺对BALB/c小鼠建立毛细血管通透性增加模型。BALB/c小鼠60只，雌雄各半，随机分为正常组、模型组、阳性药扑尔敏组(4mg/kg)，拟人参皂苷12-酮-PF11低、中、高剂量组(10mg/kg；20mg/kg；40mg/kg)。正常对照组、模型组分别灌胃给予等体积生理盐水，阳性药和拟人参皂苷12-酮-PF11各剂量组分别灌胃给药，每日一次，连续给药7天。造模方法：第7天早上采用剃发器将小鼠腹部毛剃去，末次药l h后，每只小鼠尾静脉注射1％伊文思蓝溶液(800μL/10g)，随即于腹部脱毛处皮下注射0.2mL的0.1％羟色胺肌酐硫酸盐溶液，30min后脱颈椎处死小鼠，剖开腹部，用打孔器(8mm)取下腹部蓝染皮肤，剪碎置于1.5mL的丙酮-生理盐水(1:1)溶液中，4℃匀浆后20℃浸泡保存24h，涡旋后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清，采用酶标仪于620nm测定吸光度值。

结果：如表4所示，5-羟色胺能导致小鼠毛细血管的通透性显著增加(差异具有统计学意义，###P<0.001)；给予拟人参皂苷12-酮-PF11能呈剂量依赖性地减轻小鼠毛细血管的通透性，给药拟人参皂苷12-酮-PF11高剂量效果最好(与模型组比较具有显著性差异差异有统计学意义，*P<0.05)。

表4拟人参皂苷12-酮-PF11对5-羟色胺导致的小鼠毛细血管通透性增加模型的影响

结论：拟人参皂苷12-酮-PF11对5-羟色胺导致的小鼠毛细血管通透性增加有一定的抑制作用。

试验例4：拟人参皂苷12-酮-PF11对组胺导致的小鼠毛细血管通透性增加的影响。

采用组胺对BALB/c小鼠建立毛细血管通透性增加模型。动物分组与给药方式和剂量同试验例3。造模方法：将试验例3中的0.2mL每只的0.1％羟色胺肌酐硫酸盐溶液换为0.1mL每只的0.1％磷酸组胺溶液，其余操作同试验例3。

结果：如表5所示，组胺能导致小鼠毛细血管的通透性显著增加(差异具有统计学意义，###P<0.001)；给药拟人参皂苷12-酮-PF11能呈剂量依赖性地减轻小鼠毛细血管的通透性，中剂量组和高剂量组与模型组比较具有显著性差异(差异有统计学意义，**P<0.01，***P<0.001)，给药拟人参皂苷12-酮-PF11高剂量的效果最好。

表5拟人参皂苷12-酮-PF11对组胺导致的小鼠毛细血管通透性增加的影响

结论：拟人参皂苷12-酮-PF11对组胺导致的小鼠毛细血管通透性增加有一定的抑制作用。

拟人参皂苷12-酮-PF11及提取方法及其医药用途专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。