专利摘要

一种磺酸结合物的分离方法，以羟基化合物(含酚羟基及醇羟基)底物经化学衍生或生物转化后的混合物为原料，借助复合材料填充的色谱柱，同时利用不同pH值的洗脱剂实现羟基化合物及其磺酸结合物酸度依赖性的快速分离。本发明在制备磺酸结合物时具有广泛的适用性，适于所有含酚(醇)羟基但不含有酸性基团的磺酸结合物的纯化与制备。

权利要求

1.一种磺酸结合物的分离方法，其特征在于：

(1)化学衍生或生物转化过程：将底物经过化学衍生或生物转化过程，形成底物和其磺酸结合物的混合物；

(2)分离纯化过程：将上述得到的混合物作为原料，借助复合材料填充的色谱柱，同时利用不同pH值的洗脱剂实现混合物原料的快速分离。

2.按照权利要求1所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述底物为含有酚羟基或/和醇羟基，并且不含酸性基团的化合物。

3.按照权利要求1所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述生物转化是指底物经过含有磺酸化转移酶的生物体系的催化生成磺酸结合物；所用的转移酶源包括下述几种之一或组合：重组表达的磺酸基转移酶SULT、含有SULT酶的动物组织匀浆、含有SULT酶的细胞液。

4.按照权利要求1和3所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述生物转化过程中要求加入3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯或者其对应的锂盐，其加入的摩尔量为底物的1-100倍；反应在pH值为6-8的缓冲盐溶液里进行，并保持30-50℃的转化温度。

5.按照权利要求1所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述色谱柱中的填料为同时键合反相硅胶和阴离子交换树脂的混合填料，上述两种填料的体积比介于0.2-5；两种填料颗粒的粒径介于10-200μm。

6.按照权利要求1和5所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述色谱柱中的填料的用量为原料质量的20-100倍。

7.按照权利要求1所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述步骤(2)的分离纯化过程为将混合物原料溶解后置于色谱柱的柱头，然后分别用水、有机溶剂、酸化有机溶剂淋洗。

8.按照权利要求7所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述有机溶剂为下述溶剂中的一种或混合溶剂：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮。

9.按照权利要求1所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述酸化有机溶剂中所使用的酸为低沸点的有机酸。

10.按照权利要求9所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述酸化有机溶剂中所使用的酸为甲酸或乙酸。

11.按照权利要求7所述磺酸结合物的分离方法，其特征在于：所述水淋洗过程所用水量不低于2倍柱体积；有机溶剂淋洗过程所用有机溶剂量不低于2倍柱体积；酸化有机溶剂淋洗过程所用酸化有机溶剂的量不低于5倍柱体积。

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，特别提供了一种磺酸结合物的制备方法。 

背景技术

药物代谢是机体防御外来物质入侵的最主要方式，被认为是机体抵御外来有害物的重要生化屏障。磺酸结合代谢是机体中一类重要的II相结合代谢反应，在内源性小分子(如甾体类、儿茶酚胺类、花生酸类等)和外源性物质(如药物)的生物转化中起着重要的作用(Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2004；369：55-68；Toxicol Sci 2006；90：5-22.)。大多数药物经磺酸结合反应后，生成的磺酸化结合物同底物相比具有更高的溶解度，因此更易于排出体外，从而起到降低药效和毒性的作用。但一些化合物在进行磺酸结合后会形成活性中间体，从而与DNA等大分子通过共价键结合而诱导癌症的发生(Chem Biol Interact 1998；109：221-235)。因此，制备药物的磺酸结合物对临床上安全有效用药具有非常重要的意义。 

磺酸结合物的合成方法主要分为两类：化学衍生法和生物转化法。化学磺酸化衍生法最大的优势是反应速率快、适合大规模生产，但其反应条件苛刻(常常需要强酸强碱或高温)，对于部分化学稳定性差的底物，化学衍生往往产生多种副产物。与化学法相比，生物法具有良好的适用性，可普遍应用于不同结构类型底物的制备，但在制备成本上往往高于化学法。因此，对于特定底物磺酸化产物的制备，可依据底物结构及化学属性选择化学法或生物法达到制备目标磺酸结合物的目的。但是，无论是化学法还 是生物法都存在反应终体系成分不单一，目标产物纯度较低等问题。如何实现对目标磺酸结合物单体的快速纯化制备已成为磺酸结合物制备的关键步骤。然而，目前尚缺少快速分离磺酸结合物单体的有效方法，因此有必要开发一种实用、快速、且高选择分离目标磺酸结合物的技术。 

发明内容

本发明的目的是提供一种磺酸结合物的分离方法，该方法不仅操作简单，而且可以快速获得大量的磺酸代谢产物。 

本发明提供了一种磺酸结合物的分离方法，该方法为底物经过化学衍生或生物转化过程，形成底物和其磺酸结合物的混合物，以此混合物为原料，借助复合材料填充的色谱柱，同时利用不同pH值的洗脱剂实现混合物原料的快速分离。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述方法的要求依次是： 

首先进行化学合成或生物转化处理：磺酸化等化学衍生或含有磺酸化转移酶的生物转化体系将底物全部或部分转化为磺酸结合物并获得待分离样品。所用的酶具体为：重组表达的磺酸转移酶(即：SULT)，或为来源于动物组织的含有SULT酶活性的微粒体或含有微粒体的细胞液(S9)，动物组织优选自肝、肾、肠等强代谢能力的组织；所述底物是含有酚(醇)羟基但不含酸性基团的化合物； 

其次进行分离纯化处理：将上述生物转化过程获得的反应样品通过快速色谱柱富集并纯化后获得目标磺酸结合物；所述快速色谱柱所用填料为含有反相硅胶和阴离子交换树脂的混合填料，两种填料的体积比介于0.2-5；所用硅胶键合有苯基，C8和C18中的一种碳链，硅胶粒径介于10-200μm， 所用阴离子离子交换树脂中要求含有伯胺基、仲胺基、叔胺基、季氨基中的一种碱性基团。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述生物转化过程需要3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸酯或者其对应的锂盐等在为生物催化过程提供磺酸基团，其加入的摩尔用量为底物摩尔用量的1-100倍；反应在pH值为6-8的缓冲盐溶液里进行，并保持30-50℃的转化温度(优选35-40℃)。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述快速色谱柱的填料中，硅胶键合有不同长度碳链，碳链长度优选C8和C 18，粒度优选40-60μm。阴离子交换树脂为弱碱性或强碱性离子交换树脂，优选含有伯胺基或仲胺基团的离子交换树脂，树脂粒径为0.2-1mm。两种填料的总质量为不低于底物和代谢产物总质量的20倍。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述的分离纯化过程为将混合物原料溶解后置于色谱柱的柱头，然后分别用水、有机溶剂、酸化有机溶剂淋洗。所述的有机溶剂优选为醇。所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮中的一种或混合溶剂，优选为醇。所述酸化有机溶剂中所使用的酸为低沸点的有机酸，优选为甲酸或乙酸。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述化学合成或生物转化样品置于快速色谱柱柱头后，先后经过水淋洗、醇淋洗及酸化醇淋洗的过程，水淋洗旨在洗脱反应液里水溶性物质，醇淋洗旨在洗脱底物和反应液里其它脂溶性物质，酸化醇淋洗旨在洗脱磺酸结合物。所用醇为甲醇、乙醇或异丙醇等脂肪醇；所用酸为甲酸或乙酸等低沸点有机酸，醇中酸的摩尔浓度为0.01-0.1mol/L。水洗过程中水的用量不低于2倍柱体积；醇具体为甲 醇或者乙醇，醇淋洗的节点为洗脱液里不再含有底物；酸化醇的用量为柱体积的5倍。 

本发明提供的磺酸结合物的分离方法，所述化学合成或生物转化样品上柱且依次通过水洗、醇洗、酸化醇洗之后，经高效液相色谱及液相-质谱检测，代谢产物富集于酸化甲醇中；然后经低压蒸发或惰性气体(N₂)吹干，即得纯度＞95％的代谢产物。 

磺酸结合代谢是由磺酸转移酶(SULT)介导的反应，基于传统生物法制备磺酸结合物的缺陷，本发明以羟基化合物经化学衍生法或生物转化后的混合物为原料，借助离子交换树脂和反相填料复合材料填充的色谱柱，同时利用不同pH值的洗脱剂对磺酸结合物进行酸度依赖型的快速分离。不仅操作简单，而且可以快速获得大量的磺酸代谢产物。 

同已有磺酸结合物的分离方法相比，本发明具有如下优点： 

1)操作简便高效，不需从动物体内富集，也不需多步纯化； 

2)具有广泛的适用性，适于所有含有酚羟基同时不含有酸性基团的SULT底物相应磺酸结合物的分离。 

附图说明

图1为利用生物转化(化学衍生)制备磺酸化孕烯醇酮的流程图； 

图2为脂蟾毒配基磺酸结合物的高效液相色谱图； 

图3为脂蟾毒配基磺酸结合物的质谱图； 

图4为8-磺酸基瑞香素的结构和质谱图； 

图5为7-磺酸基瑞香素的结构和质谱图。 

具体实施方式

实施例1，孕烯醇酮磺酸结合物的制备，如下所示： 

1)经生物转化法制备分离样品：孕烯醇酮溶于甲醇当中配成5mg/ml的贮存液，取出20ml加入pH7.4的磷酸盐的缓冲盐，搅拌后依次加入大鼠肝胞浆(RLC)，加入磺酸基的供体PAPS，体系中酯蟾毒配基终浓度为0.10mg/ml，蛋白终浓度为0.5mg/ml，PAPS终浓度0.2mM，37℃恒温水浴搅拌孵育2h。HPLC检测底物转化率达50％以后将反应液转移至-80℃冰箱中冷却。取反应液100ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中硅胶键合有苯基，粒径为40μm，用量为2.5g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为2.5g。先后用10ml水淋洗，10ml甲醇淋洗，30ml甲酸化甲醇淋洗。2)经化学衍生法制备分离样品：三氧化硫-三甲基胺复合物(0.137g，0.96mmol)溶于吡啶(5ml)与孕烯醇酮(0.126g，0.039mmol)在室温下混合均匀，混合物于55℃回流加热12小时。待反应混合物冷却至室温，转移并减压富集。反应混合物复溶于甲醇(100ml)后上样于快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中硅胶键合有苯基，粒径为40μm，用量为25g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为25g。先后用100ml水淋洗，100ml甲醇淋洗，300ml甲酸化甲醇淋洗(图1)。 

酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干，生物转化法制得磺酸结合物7.9mg， 化学衍生法制得磺酸结合物110mg。 

实施例2，酯蟾毒配基磺酸结合物的制备，如下所示： 

酯蟾毒配基溶于二甲基亚砜(DMSO)当中配成5mg/ml的贮存液，取出20ml加入pH7.4的磷酸盐的缓冲盐，搅拌后依次加入人重组单酶rhSULT2A1，加入磺酸基的供体PAPS，体系中酯蟾毒配基终浓度为0.10mg/ml，蛋白终浓度为0.25mg/ml，PAPS终浓度0.2mM，37℃恒温水浴搅拌孵育2h。HPLC检测底物转化率达50％以后将反应液转移至-80℃冰箱中冷却。取反应液100ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中硅胶键合有苯基，粒径为40μm，用量为2.5g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为2.5g。先后用10ml水淋洗，10ml甲醇淋洗，30ml甲酸化甲醇淋洗。酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干得磺酸结合物7mg，HPLC纯度＞95％(图2和图3)。 

实施例3，瑞香素磺酸化代谢产物制备 

瑞香素溶于甲醇中配成5mg/ml的贮存液，取出30ml加入pH7.4的磷 酸盐的缓冲盐，搅拌后依次加入大鼠肠S9(RIS9)，加入磺酸基的供体PAPS，体系中瑞香素终浓度为0.10mg/ml，蛋白终浓度为0.5mg/ml，PAPS终浓度0.2mM，37℃恒温水浴搅拌孵育1h。HPLC检测底物转化率达50％以后将反应液转移至-80℃冰箱中冷却。取反应液100ml直接上快速色谱柱。该快速色谱柱的填料为混合填料，其中硅胶键合有苯基，粒径为40μm，用量为4g，离子交换树脂含有仲氨基，用料为4g。先后用20ml水淋洗，20ml甲醇淋洗，40ml甲酸化甲醇淋洗，实现对磺化产物的富集。酸化甲醇淋洗液于室温下N₂吹干浓缩，利用制备高效液相对两个代谢产物进一步分离纯化，制得瑞香素-7-硫酸酯5.1mg(图5)和瑞香素-8-硫酸酯3.9mg(图4)。 

一种磺酸结合物的分离方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。