专利摘要

本发明公开了一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母及其应用，属于发酵工程领域。本发明从白酒酒醅中筛选得到一株能够自身从头合成多种萜类物主的酿酒酵母，该菌株已于2013年9月4日保藏于中国普通微生物中心，保藏编号是CGMCCNo.8130，该菌株经液态或固态发酵培养，可以产生里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯10种萜类物质。在酿酒过程中添加该酵母菌株，可以改善白酒的风味并提高其营养价值。 CGMCCNo.8130 2013.09.04

权利要求

1.一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其特征在于，于2013年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.8130。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母，其特征在于，所述酵母能生产里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯。

3.一种利用权利要求1所述酿酒酵母生产萜类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）种子培养：将酿酒酵母接种到种子培养基装液量为40%的锥形瓶中，摇床转速150rpm，30℃培养24～48h；

（2）发酵培养：以1%～5%（v/v）的接种量将种子培养液接入发酵培养基装液量40%的锥形瓶装培养基，摇床转速150rpm，30℃培养48～72h；

所述种子培养基：YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，0.22μm滤膜过滤除菌；

所述发酵培养基：KH₂PO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，MgSO₄0.5g/L，NaCl0.1g/L，CaCl₂0.1g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，0.22μm滤膜过滤除菌。

4.权利要求1所述酿酒酵母在食品领域的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在白酒酿造过程中接种所述酵母改善酒的风味、提高白酒中萜类物质的含量。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述萜类是里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯和没红药烯。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述接种是接种液态菌剂，所述液态菌剂是将种子液接种到灭菌后的液体培养基中，30℃、150rpm摇瓶发酵24～48h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述液体培养基是高粱、大麦、小麦、豌豆、玉米、麸皮、糯米或青稞汁。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述接种是接种固态菌剂，所述固态菌剂是将种子液接种到灭菌后的原料培养基中，在30℃环境中固态发酵48～120h。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述原料培养基是高粱、大麦、小麦、豌豆、玉米、麸皮、糯米或青稞。

说明书

技术领域

本发明涉及一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母及其应用，属于发酵工程技术领域。

背景技术

萜类物质是葡萄酒中的最为重要的一类化合物，具有水果香、花香等令人愉悦的香味；另外，萜类其具有较高的生理活性以及很高的药理作用，具有保健功能。萜类物质一般具有很低的香气阈值，其也被确认为中国白酒的重要微量风味物质，但是除了药香型白酒中含有较为丰富的萜类物质外，其他香型的白酒中萜类物质的含量都很低（10μg/L左右），因此，提高白酒中萜类物质的含量，不仅可以从风味上改善白酒的品质，更能增加白酒的营养价值。

目前国内外报道的能够合成萜类物质的酿酒酵母所能合成的萜类物质种类限于里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、法呢醇、香叶醇这5种，而且关于这几种萜类物质是由酿酒酵母从头合成，还是需要利用某种特殊的原料/中间体才能合成仍无定论。葡萄酒中萜类物质被认为大部分来自于葡萄果实，在酿造过程中外加β-葡萄糖苷酶，是提高葡萄酒中萜类物质最主要的也是最认同的一种方法。而白酒中的萜类物质很少，其含量也不是很稳定，主要的问题就是白酒酿造原料中萜类物质的前体极少，而且糖苷酶有底物专一性，也只有少数几种，外加糖苷酶也不一定会提高萜类物质含量。通过向白酒中直接添加这些萜类物质，固然可以提高酒中萜类物质的含量，但是工业生产的萜类物质安全性和食用性不能得到保障，植物来源提取的萜类物质成本又非常高。因此，寻找萜类物质的产生途径并加以调控，才能达到提高萜类物质产量的效果。

本发明提供了一种增加白酒中萜类物质含量的方法，该方法的关键是一株自身合成萜类物质的酿酒酵母，这是国内首次对可以自身合成萜类物质酿酒酵母的相关报道，该菌株也是首次在白酒酿造过程中筛选得到的可以自身产生萜醇类物质的菌株，具备高效产生萜类物质的功能。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），该菌株筛选自某清香型酒酒曲中，于2013年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号是CGMCC No.8130。

获取所得菌株的26S rDNA序列，在GenBank中进行Blast对比确定其种属，与其同源序列最高的菌株为Saccharomyces cerevisiae，相似度为99%。

所述菌株能够产生里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯10种萜类物质。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种利用所述菌株生产萜烯醇的方法：

（1）种子培养基：YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，0.22μm滤膜过滤除菌；

（2）发酵培养基：KH₂PO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，MgSO₄0.5g/L，NaCl0.1g/L，CaCl₂0.1g/L，葡萄糖20g/L，pH7.0，0.22μm滤膜过滤除菌；

（3）种子培养方法：250mL锥形瓶装培养基100mL，摇床转速150rpm，30℃培养24～48h；

（4）发酵培养方法：以1%左右（v/v）的接种量接入发酵培养基，250ml锥形瓶装培养基100mL，摇床转速150rpm，30℃培养48～72h。

本发明要解决的第三个技术问题是提供所述菌株在食品领域的应用，是在酿酒过程中接种该酵母以改善酒的风味、提高白酒中萜醇类物质的含量。

所述接种既可以是液态菌剂方式，也可以是液态菌剂方式。

所述液态菌剂制取方法：将种子液接种（接种量2-10%）到灭菌后的液体培养基（原料1～5%，v/v），30℃、150rpm摇瓶发酵24～48h；所述原料是高粱、大麦、小麦、豌豆、玉米、麸皮、糯米或青稞汁。

所述固态菌剂制取方法：将种子液接种（接种量2-10%）到灭菌后的原料培养基中（1～5%，w/w），在30℃环境中固态发酵48～120h；所述原料培养基是高粱、大麦、小麦、豌豆、玉米、麸皮、糯米或青稞。

在白酒酿造过程中以固态接种或者液态接种的形式加入所述酵母，能够增加白酒中里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯10种萜类物质的浓度，可以改善酒的风味并提高酒的营养价值。

本发明首次提供了一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母，该菌株从某清香型酒醅中筛选得到，液态以及固态发酵表明，不需特殊前体物质，该菌株就可以产生多种萜类物质，包括里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯10种萜类物质。在酿酒过程中，接入该菌可以改善酒的风味、提高酒的营养价值、实现中国白酒品质的提升，对于中国白酒的技术进步和发展具有重要的意义。

附图说明

图1菌种系统进化树（CGMCC8130）

具体实施方式

实施例1酵母液态发酵产萜烯类物质的研究

将所述酿酒酵母CGMCC No.8130接种于YNB发酵培养基中，150rpm、30℃液态发酵48h，通过HS-SPME-GC-MS测定萜烯类物质的含量，其具体方法如下：

1.样品准备：在发酵液中加入1%的CaCl₂，溶解后在4℃下以8000rpm的转速离心10min，取上清后在用0.22μm的滤膜过滤。

2.气相色谱-质谱联用检测：在15mL顶空瓶中加入8mL澄清溶液，3g氯化钠，加入10μL的4-甲基-2-戊醇作为内标，进行顶空固相微萃取。顶空固相微萃取的条件为：三相(Car/DVB/PDMS)萃取头，60℃预热5～10min，萃取吸附30～50min，GC解吸5～10min。

3.定性定量：通过未知成分的质谱计算得到保留指数RI，与相应酿造产品（如白酒、红酒等）中的常规成分的标准品的保留指数进行比对，以此定性确认检测出的挥发成分；将定性后的待测物质相对于内标做标准曲线，经GC-MS检测后利用待测物质和内标物质相对峰面积比代入相应的标准曲线方程计算出待测物质的含量：每种待测物质的峰面积采用选择离子方法积分（SIM）。

该株酿酒酵母发酵液中的萜烯醇类物质组成情况如表1所示，发酵液的总含量可达到71.66ug/L，在组成上，我们可以发现了里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、月桂烯醇、橙花叔醇、α-没红药醇、法尼醇、α-法呢烯、β-法呢烯、没红药烯10种萜类物质，其含量分别为5.55μg/L、27.17μg/L、2.26μg/L、6.21μg/L、10.14μg/L、4.00μg/L、14.16μg/L、8.34μg/L、3.27μg/L、1.56μg/L。

表1：萜类物质组成及含量（μg/L）

实施例2酿酒酵母CGMCC No.8130与商业用酿酒酵母S288C固态发酵产萜类物质的差异以及与白酒生产过程中产萜类物质的比较

实验室模拟酿造过程，分别添加该株酿酒酵母与商业用酿酒酵母，用高粱为原料进行固态发酵，具体方案如下：

1.原料的处理：将200g置于大烧杯中，加入300mL的蒸馏水，100℃水浴处理2h，中途补水以维持一定的水分，之后加入糖化酶5mL（100U/mL）60℃处理4h，分装（50g/袋）在耐高温塑料袋中110℃灭菌30min。

2.接种及发酵：将活化好的菌株按相同的量接入已灭过菌的高粱中，在30℃下固态培养15～30天。

萜醇含量的检测：取发酵好的高粱或酒醅5g于50mL离心管中，加入3%的CaCl₂水溶液，在4℃环境中浸泡12～24h，超声处理2～5h，8000rpm离心10min取上清液，用0.22μm的滤膜过滤后，通过HS-SPME-GC-MS测定萜类物质的含量。最终的结果如下表2，表明CGMCC No.8130能够产生比S288C商业酵母更多的萜烯种类与浓度。

表2：萜类物质组成及含量（μg/Kg）

注：nd，未检出。

实施例3添加酿酒酵母CGMCC No.8130提高白酒中萜类物质含量，改善白酒风味。

将酿酒酵母（CGMCC No.8130和商业用）分别活化后，按照1%的接种量（终浓度在10⁷cfu/kg）添加到已经混合好大曲的酒醅中，然后继续按传统工艺发酵。

将酒样稀释到10°后，通过HS-SPME-GC-MS测定萜类物质的含量。分析结果如表3，与正常对照组相比，添加酿酒酵母CGMCC No.8130组白酒中萜类物质种类和含量明显增多，而添加商业酿酒酵母组中白酒中萜类物质种类和含量与对照相比差别不大。

表3：萜类物质组成及含量（μg/L）

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

一株能自身合成萜类物质的酿酒酵母及其应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。