专利摘要

本发明公开了一种以2‑噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物及其合成方法，合成方法是取氨基硫脲，加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入2‑噻吩甲醛，混合均匀，将混合溶液在水浴70℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体；取制得的配体加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入CuBr2·2H2O，在水浴70℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体的Cu化合物。本发明进一步对合成的铜化合物进行了体外增殖抑制活性实验，结果表明，合成的系列铜化合物对其体外活性普遍较好，特别是对人T24和HeLa细胞具有高度特异性，表现出很好的抑制活性，并且对人正常细胞毒性作用不大，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

权利要求

1.一种以2-噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物的合成方法，其特征在于，所述铜化合物的结构式如下式C1-C3所示：

C1

C2

C3

C1-C3所示铜化合物的合成路线为：其中反应式中的CuBr2采用CuBr2·2H2O；

C1-C3所示铜化合物的合成方法，包括以下步骤：

（1）取氨基硫脲、4-甲基-3-氨基硫脲或4-苯基-3-氨基硫脲，加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入2-噻吩甲醛，混合均匀，将混合溶液在水浴70 ℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体；

所述氨基硫脲、4-甲基-3-氨基硫脲或4-苯基-3-氨基硫脲与2-噻吩甲醛的摩尔比为1:1

（2）取制得的配体加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入CuBr2·2H2O，在水浴70 ℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体的 Cu化合物；

所述配体与CuBr2·2H2O的摩尔比为1:1.5。

2.根据权利要求1所述的铜化合物的合成方法，其特征在于：合成时采用以下具体步骤：

（1）称取1mmol的氨基硫脲、4-甲基-3-氨基硫脲或4-苯基-3-氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25 mL无水乙醇搅拌半小时，用移液枪按 1:1 的比例量取 1 mmol2-噻吩甲醛加入烧瓶中，在水浴 70 ℃条件下搅拌 2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发4-6天有晶体析出，得配体；

（2）称取 0.5 mmol 的配体，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25 mL 无水乙醇搅拌半小时，加入0.75 mmol CuBr2·2H2O，在水浴 70 ℃条件下搅拌 2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发6-8天有晶体析出，得到配体的 Cu化合物。

说明书

技术领域

本发明涉及铜化合物，具体是一种以2-噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物及其合成方法。

背景技术

癌症是威胁人类身体健康的首要因素，由于目前癌症的治愈率极低，因此癌症被人们称之为“绝症”。根据癌症的类型、生长位置以及发病程度，癌症的治疗被分为很多种方法，包括手术切除、放射疗法、化学疗法和靶向治疗，这些治疗方法均具有一定的局限性。免疫疗法自1997年第一次用于治疗癌症，现已成为科学家们重要的研究方向。近年来,免疫相关的肿瘤治疗方案让人们看到了治愈癌症的希望.金属元素在免疫应答和肿瘤治疗中的重要作用正逐渐受到关注,是未来发展的重要方向。然而,目前大多数研究仅仅停留在现象描述阶段,难以在分子层面阐明机制。越来越多的证据表明,金属元素在人体免疫应答的多个方面都发挥着关键作用。首先,免疫信号转导是免疫应答的核心过程,而近年来发现多种金属离子,如钙、锌、铜、锰和镁等都与免疫细胞的活化有着直接的关系。基于不同金属的药理特性，铜类配合物无疑是最佳的选择，铜作为一种重要元素，被发现在所有的生物体中，是氧化还原化学和生长发育中的关键微量元素，它对参与生物体中的能量代谢、呼吸、免疫调节有着极其重要的角色，还有在细胞运输、底物氧化和氧化还原调节都起着重要的作用。

氨基硫脲与酮或醛缩合可以获得缩氨基硫脲。缩氨基硫脲及其金属配合物因具有较高的抗肿瘤活性而受到人们的青睐。许多的研究表明，以芳烃和杂环胺合成的氨基希夫碱对人的癌细胞有较好的活性。近三十年来，研究者合成了多种铜的希夫碱配合物，如缩氨基硫脲类、吡啶类、水杨醛类等等，有些药物已经被提议作为抗癌药物。对常见的癌症如肺癌，胃癌，膀胱癌等，目前的治疗效果并不是很理想。为此，研发能够阻止肿瘤增殖的新型化合物是不可或缺的。而这最近的三十年来，因为其与金属离子的多齿配位和广泛的药理活性，使得人们开始在抗病毒、抗菌、和抗癌方面展开了广泛的研究，从而发现其生物活性主要源于母体醛或酮的那一部分。我们课题组在研究中发现我们合成的铜化合物与PD-1蛋白有相互作用，进一步增加了我们对免疫治疗肿瘤疾病的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种以2-噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物及其合成方法。

实现本发明目的的技术方案是：

一种以2-噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物，其结构式如下式C1-C4所示：

上述C1-C4所示铜化合物的合成路线如下：

本发明所述铜化合物的合成方法，包括以下步骤：

(1)取氨基硫脲，加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入2-噻吩甲醛，混合均匀，将混合溶液在水浴70℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体；

(2)取制得的配体加入无水乙醇搅拌溶解，溶解后，加入CuBr₂·2H₂O，在水浴70℃条件下搅拌，室温挥发，有晶体析出，得到配体的Cu化合物。

步骤(1)所述氨基硫脲包括4-甲基-3-氨基硫脲、4-苯基-3-氨基硫脲、N，N-2-乙基-3-氨基硫脲；氨基硫脲与2-噻吩甲醛的摩尔比为1:1。

步骤(2)所述配体与CuBr₂的摩尔比为1:1.5。

本发明所述铜化合物，合成时可采用以下具体步骤：

(1)称取1mmol的氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半小时，用移液枪按1:1的比例量取1mmol 2-噻吩甲醛加入烧瓶中，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，室温缓慢挥发4-6d有晶体析出，得配体；

(2)称取0.5mmol的配体，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半小时，加入0.75mmol CuBr₂·2H₂O，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，室温缓慢挥发6-8d有晶体析出，得到配体的Cu化合物。

实际合成时，各原料的用量可按具体步骤的用量，按倍数扩大或缩小。

本发明选择2-噻吩甲醛、氨基硫脲进行缩合反应，得到配体，该配体在人体内或细胞内与Cu螯合组成Cu化合物，研究结果表明化合物合物能够影响蛋白的表达量如调节细胞周期蛋白家族的表达(如Cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶、Bcl家族蛋白(如bcl-2，bcl-xl)、细胞凋亡相关蛋白(如Caspase-3,Caspase-9)等以及调节基因N-myc。同时对免疫治疗的PD-1/PD-L1通路也有影响。

本发明进一步对合成的铜化合物C1-C4进行了体外增殖抑制活性实验，结果表明，合成的系列铜化合物对其体外活性普遍较好，特别是对人T24和HeLa细胞具有高度特异性，表现出很好的抑制活性，并且对人正常细胞毒性作用不大，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为实施例1合成的C1铜化合物的单晶结构图。

图2为实施例2合成的C2铜化合物的单晶结构图。

图3为实施例3合成的C3铜化合物的单晶结构图。

图4为实施例4合成的C4铜化合物的单晶结构图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明内容作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：

铜配合物C1的合成，包括以下步骤：

(1)用电子天平称取1mmol的氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半小时，用移液枪按1:1的比例量取1mmol 2-噻吩甲醛加入烧瓶中，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发5d左右会有淡黄色针状晶体析出，得配体L1；过滤、自然干燥，用电子天平称重，计算产率；

Yield:88％。Anal.Calcd for C6H7N3S2:C,38.90％；H,3,81％；N,22.68％；S,34.61％.IR,cm-1(main peaks):3411.42vs,3235.04s,2997.62s,1678.78m,1582.48s,1474.50s,1279.45m,1097.79m,920.94s,834.57vs,708.52vs,615.74s,525.03m,411.19s.ESI+m/z:calcd for C6H7N3S2,185.01[M-H]；

(2)用电子天平称取0.5mmol的配体，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半小时，加入0.75mmol CuBr₂·2H₂O，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发7d左右有黄色晶体析出，得到配体L1的Cu化合物；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:83％。挑选形状规则的金属配合物用单晶衍射仪测得其结构。Anal.Calcdfor C36H42Br3Cu3N18S12:C,27.99％；H,2.94％；N,16.32％；S,24.9％；Br,15.52％.IR,cm-1(main peaks):3412.39s,3235.42m,3144.78s,2996.59w,1581.47s,1536.90vs,1474.73w,1323.48m,1278.57m,1098.26s,843.94s,707.79s,523.61m,411.28s.ESI+m/z:calcd for C36H42Br3Cu3N18S12:1539.59[M-H]。

实施例2：

铜配合物C2的合成，包括以下步骤：

(1)用电子天平称取1mmol的4-甲基-3-氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子,加入25mL无水乙醇搅拌半小时，用移液枪按1:1的比例量取1mmol 2-噻吩甲醛，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发4-6d会有淡黄色晶体析出，得配体L2；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:82％。Anal.Calcd for C7H9N3S2:C,42.19％；H,4.55％；N,21.08％；S,32.18％.IR,cm-1(main peaks):3373.34m,3340.24m,3173.13s,2997.05m,1592.30m,1542.57vs,1379.21m,1271.24s,1224.31m,1086.88s,1036.38s,923.81s,717.54vs,561.97s.ESI+m/z:calcd for C7H9N3S2,199.02[M-H]；

(2)用电子天平称取0.5mmol的配体，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子,加入25mL无水乙醇搅拌半小时，加入0.75mmol CuBr₂·2H₂O，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发7d有黄色晶体析出，得到配体L2的Cu化合物；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:89％。挑选形状规则的金属配合物用单晶衍射仪测得其结构。Anal.Calcdfor C28H38Br2Cu2N12S8Cu2:C,30.96％；H,3.53％；N,15.48％；S,23.62％；Br,14.71％.IR,cm-1(main peaks):3318.72s,314.78s,3000.42s,2946.27m,1546.95vs,1435.29m,1259.67s,1092.38s,1034.97s,921.02m,819.52m,707.79s,635.09s,572.60m.ESI+m/z:calcd for C28H38Br2Cu2N12S8,1085.80[M-H]。

实施例3：

铜配合物C3的合成，包括以下步骤：

(1)用电子天平称取1mmol的4-苯基-3-氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半个小时，再用移液枪按1:1的比例量取1mmol 2-噻吩甲醛缓慢加入烧瓶中，边搅拌边加，在水浴70℃条件下搅拌反应2h，取出过滤放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发5d会有淡黄色晶体析出，得配体L3；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:89％。Anal.Calcd for C12H11N3S2：C,55.41％；H,4.24％；N,16.08％；S,24.54％.IR,cm-1(main peaks):3300.11s,3141.10s,2986.89s,1591.61m,1545.22vs,1444.40m,1386.97s,1272.00s,1204.98s,1074.91m,923.03s,705.34s,524.10s.ESI+m/z:calcd for C12H11N3S2,261.04[M-H]；

(2)用电子天平称取0.5mmol的配体，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL的无水乙醇搅拌半小时，加入0.75mmol CuBr2·2H2O，在水浴70℃条件下搅拌反应2h，取出过滤放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发6d有黑色晶体析出，得到配体L3的Cu化合物；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:86％。挑选形状规则的金属配合物用单晶衍射仪测得其结构。Anal.Calcdfor C48H32Cu4N12S8:C44.05％；H,3.64％；N,12.84％；S,19.60％；Cl,4.33％.IR,cm-1(main peaks):3432.11m,3105.05s,2940.25m，1554.79s,1498.37vs,1485.39s,1316.81s,1233.76s,939.16m,850.79s,696.86vs,612.78s.ESI+m/z:calcd for C48H32Cu4N12S8,1285.78[M-H]。

实施例4：

铜配合物C4的合成，合成路线如下：

合成方法包括以下步骤：

(1)用电子天平称取2mol的二乙基二硫代氨基甲酸钠(三水)溶于1L的超纯水中，再加入2mol的氯乙酸钠，加入少量NaOH，室温搅拌24h后，加入6mol/L的盐酸至白色沉淀不再增加为止，抽滤，室温干燥，称重；

取80％的水合肼，水合肼的物质的量与二乙基羟甲基硫代甲酸酯的物质的量的比例为1:1.8，120℃油浴加热0.5h，溶液会变成红色，冷却至室温，会有白色晶体析出，再加热至120℃，反复3-4次，最终得到的白色晶体即为N，N-2-乙基-3-氨基硫脲(N，N-2-乙基-3-氨基硫脲市场没有卖，通过合成得到的)；抽滤，自然干燥，放置在无水CaCl2玻璃器皿中备用；

(2)用电子天平称取1mmol的N，N-2-乙基-3-氨基硫脲，倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子，加入25mL无水乙醇搅拌半小时，再用移液枪按1:1的比例量取1mmol 2-噻吩甲醛加入烧瓶中，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发4d会有淡黄色晶体析出，得配体L4；过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:79％。Anal.Calcd(％)for C10H15N3S2:C,49.76％；H,6.26％；N,17.41％；S,26.57％.IR,cm-1(main peaks):3443.42s,2937.45s,1580.96vs,1489.66s,1413.52s,1388.53s,1278.38s,1156.62s,1064.65s,714.83s,630.36m.ESI+m/z:calcd forC10H15N3S2,241.07[M-H]；

(3)用电子天平称取0.5mmol的配体,倒入到100ml的烧瓶中，加入磁子,加入25mL的无水乙醇搅拌半小时，加入0.75mmol CuBr2·2H2O，在水浴70℃条件下搅拌2h，放在50ml烧杯中置于通风橱中，缓慢挥发8d有黑色晶体析出，得到配体L4的Cu化合物。过滤，室温干燥，称重，计算产率；

Yield:65％。挑选形状规则的金属配合物用单晶衍射仪测得其结构。Anal.CalcdforC20H31N6S4Cu:C,43.89％；H,5.71％；N,15.36％；S,23.43％.IR,cm-1(main peaks):3459.40vs,2973.25s,1605.49s,1499.85s,1433.52s,1380.49s,1269.33s,1142.02s,1059.68s,704.13s，627.86m.ESI+m/z:calcd for C20H31N6S4Cu,546.08[M-H]。

为说明本发明铜化合物，申请人对上述实施例1～4制得的铜化合物C1-C4进行了体外抗肿瘤活性实验：

1、细胞株与细胞培养

本实验选用了A549，NCI-H460，T-24，HeLa，MGC-803，对比不同的癌细胞，发现化合物对T24和HeLa细胞的活性较好，并进行了活性探究。所有细胞株均培养在含10％小牛血清、100U/mL链霉素的RPMI-1640/DMEM培养液内，置37℃含体积浓度5％CO₂孵箱中培养。

2、待测化合物的配制

所用的受试药物的纯度≥95％，将其DMSO储液用生理缓冲液稀释后配置成5mmol/L的终溶液，其中助溶剂DMSO的浓度≤1％，测试该浓度下化合物对各种肿瘤细胞生长得抑制程度。

3、细胞生长抑制实验(MTT法)

(1)取对数生长期的肿瘤细胞，经胰蛋白酶消化后，用含10％小牛血清的培养液配置成浓度为5000个/mL的细胞悬液，以每孔180μL接种于96孔培养板中，使待测细胞浓度至每孔1000～10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；

(2)5％CO₂，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底，每孔加入一定浓度梯度的药物20μL，每个浓度梯度设5个复孔；

(3)5％CO₂，37℃孵育48h，至倒置显微镜下观察；

(4)每孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL PBS，即0.5％MTT)，继续培养4h-6h；

(5)终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入100μL的DMSO充分溶解甲瓒沉淀，振荡器混匀后，在酶标仪用波长为570nm，参比波长为450nm测定各孔的光密度值；

(6)根据测得的光密度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

利用公式：

肿瘤细胞生长抑制率(％)＝[(1-实验组平均OD值)/(对照组平均OD值)]×％；

IC₅₀测定：利用以上方法，每种化合物须设置浓度梯度，其中含多个(一般5～8个)浓度，每个浓度也须设置3～5个副孔，实验得到每个不同浓度的抑制率，然后在SPSS软件中计算化合物的IC₅₀值。

表1：配体以及化合物对不同细胞株的IC₅₀值(μM)，数值越低表明化合物抑制活性越好。

实验结果表明：对于这5株癌细胞，单纯的CuCl₂、Cu2⁺以及噻吩甲醛缩氨基硫脲配体的活性都不高，噻吩甲醛缩氨基硫脲配体与铜离子配位之后，活性得到了很大的提高。实施例铜配合物C1活性最高，高于C2、C3和C4。实施例铜配合物对T-24和HeLa细胞具有高度特异性，表现出很好的抑制活性，并且对人正常细胞毒性作用不大，适用于制备高效，低毒的抗肿瘤药物。

以2-噻吩甲醛缩氨基硫脲为配体的铜化合物及其合成方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。