专利摘要

本发明涉及到核酸化学，更具体到一个领域，其中包括被修饰的2′-脱氧核苷酸的三聚磷酸被添加到一个寡核苷酸的3′-端，被添加的核苷酸的3′-羟基含有NH2保护基团，核苷酸的碱基上连有荧光标记基团，连接的链子可以被切断。这种组成成分及其相关的过程可以提高循环可逆终止策略进行寡核苷酸的测序，如美国专利6664079中所述。更具体的说，本发明涉及携带可检测的荧光标记的核糖和2′-脱氧核糖核苷的三聚磷酸，和由其衍生出来的寡核苷酸。本发明还涉及，通过一个DNA聚合酶，RNA聚合酶，逆转录酶，将上述的三聚磷酸加到一个引物进而合成上述的寡核苷酸的过程。

权利要求

1.一个组份具有以下的结构：

其中B是一个碱基，能够形成Watson-Crick碱基互补配对，如互补的DNA或RNA链中的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶，另外，T是通过可裂解的连接器连接的荧光标记基团。

2.如权利要求1所述的组份中所说的可裂解的连接器包含一个1，2-二羟基基团。

3.如权利要求2所述的组份中所说的结构选自如下的基团

4.一个组份具有以下的结构：

其中B是一个碱基，能够形成Watson-Crick碱基互补配对，如互补的DNA或RNA链中的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶。另外，T是通过可裂解的连接器连接的荧光标记基团。

5.如权利要求4所述的组份中所说的可裂解的连接器包含一个1，2-二羟基基团。

6.如权利要求5所述的组份中所说的结构选自如下

其中B是一个碱基，能够形成Watson-Crick碱基互补配对，如互补的DNA或RNA链中的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶。T是荧光标记基团，R是独立地选自氢，烷基，芳基组成的基团。

7.改进美国专利US6664079的过程，其中的改进包括，将模板和引物的复合物与DNA聚合酶相接触，并孵化上述的混合物与具有以下结构的一个或多个组份的混合物：

其中B是一个碱基，能够形成Watson-Crick碱基互补配对，如互补的DNA或RNA链中的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶。T可以是氢原子，甲基基团，或是通过可裂解的连接器连接的荧光标记。

8.如权利要求7所述的组份中所说的可裂解的连接器包含一个1，2-二羟基基团。

9.如权利要求8所述的组份中所包含的分子选自如下的结构

10.如权利要求1所述的组份中所说的可裂解的连接器包含一个二硫键单元。

11.如权利要求2所述的组份中所说的结构选自如下

12.如权利要求4所述的组份中所说的可裂解的连接器包含一个二硫键单元。

13.如权利要求12所述的组份中所说的结构选自如下

其中B是一个碱基，能够形成Watson-Crick碱基互补配对，如互补的DNA或RNA链中的腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶或尿嘧啶。T是荧光标记基团，R是独立地选自氢原子，烷基，和芳香基团。

说明书

技术领域

本发明涉及到核酸化学，更具体到用于确定核酸序列的组份和过程的领域。更进一步地说，本发明涉及相关的成分及其过程，该过程将一个荧光标记的核苷酸加到引物的3′-端，得到的产物寡核苷酸的3′-羟基被一个临时的基团保护，该基团在后续的过程中可以被去保护。

背景技术

“合成测序法”作为“使用周期可逆终止的测序”(SuCRT)是一种以模板导向的引物延伸策略，在延伸过程中，以核苷三磷酸或硫代三磷酸为基本原件，一次加入一个核苷酸。聚合反应在每个核苷酸加入后被终止。在这个时间，对引物延伸进行检查，以确定哪类核苷酸被加入，进而推断出模板中相应序列的核苷酸种类。

使聚合反应停止的一种机制是将引物3′-端羟基由一个保护基团临时的保护(或阻止)。这个保护基团可以防止聚合酶添加额外的核苷酸，直到该保护基团被去除。实践中，这个策略提供了一个任意长的时间来确定所添加核苷酸的性质。

一种确定所添加核苷酸种类的策略是让每个核苷酸携带一个荧光标记，每一种标记的荧光颜色均不同于其他的核苷酸类型。在引物延伸后，去除临时保护基团之前，被添加的核苷酸的种类可以通过读取荧光标记得以确认。完成此操作后，荧光标记和3′-端保护基团被去除，接下来下一个周期的测序被启动。在此架构中，模板导向的聚合酶反应是通过使用一种DNA聚合酶，或反向转录酶。

当输出信号为荧光时，这一战略的实施要求如下：

(一)四种dATP，dTTP，dGTP和dCTP的类似物各携带一种不同颜色的荧光染料，同时他们的3′-端被临时保护，使引物不能进一步延伸。

(二)四种类似物必须被有效的嵌入到引物，得到完全充分的引物延伸，同时可以避免其他副反应的发。

(三)四种核苷酸类似物的潜入必须忠实的根据配对规则。如果核苷酸的错配没有被校对纠正，加之如果聚合酶不能有效延长终端的不匹配，这样的引物延伸将被中断。这将逐渐减弱信号强度，并可能产生“出相”信号，扰乱了下游的输出结果。

(四)荧光染料和3′-OH的临时保护基团必须能够被高校的去除，以便在下一个核苷酸可以被高效的嵌入。不完全去保护基团会削弱信号的强度，或产生“出相”信号进而混淆下游的信号输出。对于单分子测序，未去除的3′-OH保护基团可能会失去一个序列数据的收集。

(五)增长的DNA链应该经得起清洗，检测和去保护等过程。虽然退火过程是可能的，然而，能够使DNA引物和模板保持退火状态的条件是更可取的。

在他们最雄心勃勃的形式中，合成测序的架构中将使用相同的核苷修饰方法来保护DNA的3′-端同时引进荧光标记基团[Wel99]。例如，如果一个荧光标记被附加到3′-位置是通过酯键，取代了三磷酸核苷3′-OH的氢原子，在引物延伸后要继续加人另一个核苷酸将不可能(因为没有自由的3′-OH基团)。这样便提供了时间来读取荧光标签的颜色，以便确定所添加核苷酸的性质。然后，3′-O酰基组可以在温和的条件下(pH＜10)，被温和的亲核试剂(如羟胺)去除，再生一个自由的3′-羟基基团，为下一个周期的DNA测序做准备。

实施这个优雅的测序方式的困难是找到合适的聚合酶。任何荧光标记，在电磁波谱有用区域发出荧光必须大于1纳米。聚合酶的晶体结构表明，脱氧核糖三磷酸3′-端的位置是接近聚合酶活性部位的氨基酸残基，该部位的空间大小不能容纳三磷酸3′-端的荧光基团。因此，聚合酶不太可能接受在3′-位置有这么大的标记基团。事实上，聚合酶不能很好地接受任何有3′-OH基团修饰的三磷酸。例如，接受甚至2′，3′-二脱氧核苷酸类似物(其中3′-基团比天然核苷小)，往往需要突变的聚合酶。

瞿等人，在美国专利6664079中指出这些问题，他们以多种3′-OH保护基团为基础勾画了SuCRT的建议。他们建议一个荧光或质量标签可以通过一个可裂解的连接器连到核苷三磷酸的非3′-OH单元上(图1)。这种连接器可以连接(但不限于)到嘧啶的5位(T和C)和嘌呤的7位(G和A)。根据专利US6664079，在这个位置上的标签原则上应该允许，3′-OH被一个足够小的基团临时保护，并且可以被DNA聚合酶接受。在此架构中，需要多个去保护步骤来去除荧光标签(使系统清洁以便加人下一个荧光标签)和去除3′-的保护基团，允许进行下一个循环的引物延伸[Mit03][Seo04]。

专利US6664079致力于寻找一个小的化学基团，该基团可能被聚合酶接受，并且可以在温和的条件下，且不破坏DNA序列的情况下被去除。专利US6664079引用文献报告3′-O-甲氧基脱氧核苷酸是好几个聚合酶的底物[Axe78]。它指出，去除3′-O甲氧基的条件过于强烈，以至于被测序的DNA和被使用的引物，在这样的条件下很难完好无损。

一个酯基基团同样被考虑作为一种核苷酸3′-OH的保护基团。专利US6664079丢弃这个保护基团，因为文献报道，酯基基团在DNA聚合酶的活性部位会被切割[Can95]。应该指出，这份报告值得怀疑，并且考虑的只有一种聚合酶。然而，酯键很容易受到自发的水解，尤其是，如果他们是小的酯基基团(如甲酰基团)。

具有亲电性的化学基团如酮基，能否被作为核苷酸3′-OH的临时保护基，也曾经被专利US6664079考虑过并且被丢弃了。聚合酶具有亲电中心已经被提出可以与蛋白质的氨基(如氨基基团)反应。其实，这是不可能的(例如，环戊酮没有与蛋白质侧链形成可检查量的亚胺)。然而，3′-酮2′-脱氧核糖核苷不是稳定的，通过贝塔消除反应被分解，文献中广泛的报道了核苷酸还原酶的机制。

专利US6664079然后引用了文献报道，没有外切酶活性的Vent DNA聚合酶能够将3′-O-烯丙基-dATP嵌入到增长的DNA链中[Met94]。美国专利6664079指出，甲氧甲基MOM保护基和烯丙基有相似的大小，因此，也可能被用于合成测序中保护3′-OH基的保护基团。这项专利指出，这些保护基团可以使用过渡金属试剂来去除[Ire86][Kam99]，或通过酸性试剂来去除(适用于MOM基团)。

因此，这些建议定义了US6664079中提出的发明。简单地说，这一发明的实质是在合成测序方法中的四种核苷酸类似物的三磷酸，每一种三磷酸核苷碱基上均连有一个可以被去除的特定的荧光标记，并且每个3′-OH基团的氢原子被烯丙基或甲氧甲基MOM基团取代，合成测序所得的寡核苷酸是通过聚合酶嵌入被的修饰过的核苷酸三磷酸。

不幸的是，US6664079并没有预期到其他各方面在使用循环可逆终止测序法中的实用工具，并且在前面的技术中不可行。特别是，裂解反应消除了荧光标记可能无法恢复核苷碱基到其天然的结构，在文献中被称为“伤痕”。这样就引出一个实验方面的问题，3′-端带有疤痕核苷酸的引物，能否被聚合酶延伸，同时将含有3′-O保护基和荧光标记的三磷酸类似物嵌入模板导向的聚合反应中。虽然从架构上很容易设想，使用荧光标记和未标记的三磷酸的混合物，来实施循环可逆终止测序策略，但是，通过筛选和确定聚合酶，能够将3′-端保护的和荧光标记的核苷酸三磷酸，更有效地嵌入到带有疤痕的引物中，将更可取。

附图说明

图1、使用3′-ONH2基团作为一个小型，可被去除的3′-端保护基团进行合成测序的示意图。圆圈和三角形代表不同颜色的荧光组。DNA聚合酶嵌入3′-端保护的荧光标记的核苷酸。因为3′-端的保护基团，引物延伸被终止。检测荧光颜色(确定何种核苷酸被添加)，荧光基团被去除，3′-OH的保护基团被去除。重复下一个的循环。

图2、例1.合成TTP-ONH₂

图3、例2.合成dCTP-ONH₂

图4、例3.合成dATP，ONH₂

图5、例4.合成dGTP-ONH₂

图6、例5.连接器组件的合成

图7、例6.胸腺嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3标记的合成(部分1)

图8、例6.胸腺嘧啶类核苷似物与乙炔连接和一个Cy3标记的合成(部分2)

图9、例7.胞嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3.5标记的合成(部分1)

图10、例7.胞嘧啶核苷类似物与乙炔连接和一个Cy3.5标记的合成(部分2)

图11、例8.腺嘌呤核苷类似物与乙炔连接和一个Cy5标记的合成(部分1)

图12、例8.腺嘌呤核苷类似物与乙炔连接和一个Cy5标记的合成(部分1)

图13、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分1)

图14、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分2)

图15、例9.鸟嘌呤类似物与一个附加的荧光基团的合成(部分3)

图16、例10.亚硝酸去除3′-ONH₂基团。

图17、例11.标记的三磷酸的酶法延伸。

图18、例12.使用循环可逆终止循环法测序

图19、例13.标记的3′-ONH₂三磷酸和“伤疤”的酶法延伸

图20、例14.标记的3′-ONH₂三磷酸和“伤疤”的酶法延伸

图21、例13中使用的结构。

图22、例14中使用的结构。

图23、含二硫键连接器的前体的合成路线，如例15中所述。

图24、尿苷衍生物携带含有二硫键连接器的合成路线(16例)。

图25、腺苷衍生物携带含二硫键连接器的合成路线，如例17中所述。

图26、一个含二硫键连接器尿苷衍生物的合成(例18)。

发明内容

这里所引用的美国专利编号为11/373415，建议3′-O-NH₂基团可能是一个有用的可逆终止基团，可以被用于一个循环的可逆终止(SuCRT)架构测序方法(图示1)。这个基团被包含在本发明的化合物中。这些核苷三磷酸不但携带3′-O-NH₂基团，同时在其核苷碱基上附加一个标签，这个标签可以是荧光基团，且通过一个连接器与碱基相连，连接器中包含一个功能基团，可以被一些试剂裂解。在这种情况下，可以被裂解的功能基团是1，2-戊二醇，它可以被高碘酸盐裂解，最合适的条件是在近中性pH值的水溶液中。

本专利组成成份的另一个新颖性在于3′-O-NH₂被保护成为肟的衍生物。这种以肟的形式能够保护3′-O-NH₂氨基基团，以便进行分子的其他部分的转换，包括连接器的修饰，从而引入荧光标记。在引物-模板、三磷酸与聚合酶共存的体系中，这种肟在引物延伸前可以被去掉。

在本发明的化合物中，这些荧光基团被连接在嘧啶碱基的5位或7位去氮嘌呤碱基的7位。此外，为了便于荧光基团从碱基上去除，在本发明的化合物连接器中包含一个邻近的1，2-戊二醇。这个二醇可以被高碘酸迅速的裂解。

在发展本发明组份的过程中，我们注意到，3′-ONH₂基团可以通过用丙酮或乙醛被保护为肟(虽然其他的醛类和酮类用于此目的应该有等同的功能)。此外，我们发现，储存含有3′-肟官能团的某些成分非常方便，使这些官能团有其使用的价值。

一系列的实验表明，THERMINATOR 聚合酶(新英格兰生物实验室的注册商标)可以将本专利中的四种核苷三磷酸的衍生物嵌入到引物的3′-端，这些三磷酸的衍生物分别携带一个3′-ONH₂基团和一个含有二醇的连接到碱基上的连接器，连接器上并携带一个荧光基团。此外，实验进一步地表明，THERMINATOR 聚合酶也可以将四种三磷酸的衍生物添加到3′-端含有疤痕核苷酸的引物，这个3′-端含有疤痕核苷酸的引物是前一步引物延伸后，经过高碘酸裂解含有二醇的连接器(也可以选择用sodium cyanoborohydride还原)，同时去除3′-ONH₂基团所得的引物。

本发明同时进一步的阐述了一个过程，这个过程涉及将一个引物和模板的复合物与核苷三磷酸混合在一起，其中一些三磷酸带有一个荧光标记，另外的一些核苷三磷酸没有荧光标记。这个过程在聚合酶不能有效地延伸带有“伤痕”的引物时，具有一定的优势，也就是一个引物的3′-核苷酸的碱基含有侧链片段，即一个带有侧链和荧光标记的三磷酸在被嵌入引物后，荧光基团被去除后所得的新引物。在这个过程中，未标记的3′-可逆保护的核苷三磷酸被添加到含有伤痕的引物，然而标记的3′-可逆保护的核苷三磷酸被添加到没有伤痕的引物。这样一来，这个过程可以适用于一些没有优化过的聚合酶，以标记的核苷三磷酸进行SuCRT测序。

参考文献

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具体实施方式

例1.TTP-ONH₂的合成(图2)

3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-胸苷(1a)的制备依据以下的文献：[De Clercq，E.，Inoue，I.，Kondo，K.(1990)Preparation of 3-O-amino-2′-deoxyribonucleoside derivatives as antiviral agents for human retrovirus，particularly human immunodeficiency virus.Eur.Pat.Appl.14pp]，[Kondo，K.，Ogiku，T.，Inoue，I.(1985)Synthesis of 5′(3′)-O-amino nucleosides.Symp.Nucleic Acids Chem.16，93-96]，[Burgess，K.，Gibbs，R.A.，Metzker，M.L.，Raghavachari，R.(1994)Synthesis of an oxyamide linked nucleotide dimer and incorporation into antisense oligonucleotide sequences.J.Chem.Soc.Chem.Commun.8，915-916]，[Cook，P.D.，Sanghvi，Y.S.(1994)Preparation of antisense heteroatomic oligonucleotide analogs.PCT Int.Appl.90pp].。从这些文献中引用的程序被特别的纳入本说明中。这种材料(1.15克，3.0毫摩尔)被溶解于甲胺的水溶液中(4％，22毫升，约24毫摩尔)。在室温(RT)20分钟后，大部分的甲胺有抽真空被去除，剩余的溶液用丙酮(3毫升)来处理。在室温后3h，挥发物在真空中被去除。残留物被溶解于水(25毫升)和乙腈(7毫升)的混合物中。不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度从25％到50％的洗脱液B历时7分钟，在接下来的8分钟然洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝14分钟时，得到了3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c，640毫克，72％)，冷冻干燥后为无色泡沫状。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝1.79(d，J＝0.9Hz，3H)；1.83(s，3H)；1.84(s，3H)；2.15-2.35(m，2H)；3.55-3.70(m，2H)；3.98-4.05(m，1H)；4.68-4.72(m，1H)；5.15(br.s，1H)；6.17(dd，J＝5.7，8.7Hz，1H)；7.76(d，J＝0.9Hz，1H)；11.3(br.s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝12.3；15.5；21.5；36.4；61.8；82.1；83.9；84.1；109.6；136.0；150.5；155.8；163.7.

3′-O-(N-丙酮肟)-胸苷-5′-三磷酸腺苷(1d)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-胸腺嘧啶(1c，300毫克，1.0毫摩尔)的吡啶(4毫升)和二恶烷(3.4毫升)的溶液中，在室温条件下，加入2-氯-4H-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(260毫克，1.4毫摩尔)的二恶烷(2.6毫升)溶液。10分钟后，加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，10毫升，2毫摩尔)和三丁基胺(1.2毫升，4.8毫摩尔)的混合物。再过10分钟后，碘(360毫克，1.4毫摩尔)和水(0.56毫升)的吡啶溶液(28毫升)被加入。20分钟后，该反应亚硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。溶剂通过真空被去除。残留物被溶于水(50毫升)中，所得的混合物被过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱法纯化所得的产物，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝13分)，其次是反相高效液相色谱法进一步的纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米色谱柱，流动相A＝25毫米TEAA pH值7，洗脱液B＝50％乙腈和水，梯度为乙腈从0到70％历时20分钟，流量＝5毫升/分钟，保留时间(RT)＝19分钟，3′-O-(N-丙酮肟)-5-胸苷三磷酸经过冻干后为无色泡沫状。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝8800Lmol^-1cm^-1)确定为450微摩尔(45％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.75-1.79(m，9H)；2.18-2.40(m，2H)；4.00-4.15(m，2H)；4.22-4.27(m，1H)；4.46(s，2H)；4.78-4.85(m，1H)；6.21(dd，J＝5.7，9.1Hz，1H)；7.67(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.5(d，J＝20.0Hz，1P)；-11.7(d，J＝20.0Hz，1P)；-23.3(t，J＝20.0Hz，1P).

3′-O-氨基-胸苷5′-三磷酸腺苷(1e)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-5-胸苷三磷酸(1d，100微摩尔)的水溶液中(10毫升)加入醋酸钠缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(50WT％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2小时后，反应体系被水(20毫升)稀释后过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0到30％的B历时20分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝15分)，3′-O-氨基-胸苷5′-三磷酸腺苷在冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝8800Lmol^-1cm^-1)确定为82微摩尔(82％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(d，J＝0.9Hz，3H)；2.18-2.29(m，¹H)；2.37-2.46(m，1H)；4.01-4.16(m，2H)；4.25-4.29(m，1H)；4.61-4.63(m，1H)；6.17(dd，J＝5.8，9.0Hz，1H)；7.62(d，J＝1.2Hz，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.8(d，J＝20Hz，1P)；-11.7(d，J＝20Hz，1P)；-23.1(t，J＝20Hz，1P).

例2.dCTP-ONH2的合成(图3)

5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2b)。

在N⁴-苯甲酰-5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2a，8.9克，14毫摩尔)，苯甲酸(2.5克，20毫摩尔)和三苯基膦(5.2克，20毫摩尔)的四氢呋喃(150毫升)溶液中，在0℃下加入DIAD(3.7毫升，20毫摩尔)。反应体系的温度过夜后升到室温，然后，用水(0.5毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为乙酸乙酯∶正己烷＝1∶1，最后为100％的乙酸乙酯)分离纯化，得到了N⁴-苯甲酰-3′-O-苯甲酰-5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(13.7克)为无色的泡沫，根据核磁共振，含有大量的三苯基膦氧化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被重新溶解在甲醇(450毫升)中，同时用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，4毫升，21毫摩尔)来处理。室温2小时后，反应被冰醋酸(1.25毫升)淬灭。反应溶剂用真空油泵被去除，并用二氯甲烷(300毫升)和氯化钠的水溶液(50％的盐浓度，150毫升)来萃取所得的残留物。有机相被分离同时被真空油泵浓缩。反应产物经过快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为甲醇∶二氯甲烷＝5∶95到10∶90)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(4.6克；62％的总产率)为无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝1.78-1.87(m，1H)；2.46-2.55(m，1H)；3.19-3.24(m，1H)；3.37-3.43(m，1H)；3.76(s，6H)；4.07-4.12(m，1H)；4.16-4.19(m，1H)；5.10-5.20(m，1H)；5.66(d，J＝7.4Hz，1H)；6.07(dd，J＝1.7，7.9Hz，1H)；6.86-6.92(m，4H)；7.16(br s，2H)；7.18-7.48(m，9H)；7.68(d，J＝7.4Hz，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝41.4；55.0；62.8；69.2；83.4；85.4；85.5；93.0；113.1；126.6；127.8；129.8；135.6；135.7；141.6；145.0；155.2；158.0；165.6.

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(2c)。

在5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧胞苷(2b，3.4克，6.4毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(1.6克，10毫摩尔)和三苯基膦(2.6克，10毫摩尔)的四氢呋喃(180毫升)溶液中在0℃下加入DIAD(1.9毫升，10毫摩尔)。反应体系的温度过夜后升到室温，然后，用水(0.5毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为90∶10)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl-3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(3.7克)为无色的泡沫。根据核磁共振，含有大量的三苯基膦氧化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被重新溶解在甲醇(150毫升)中，同时用浓盐酸的水溶液(7.5毫升)来处理。在室温下几分钟内，该产品开始沉淀。10分钟后，所得的固体被过滤，并在高真空下干燥，最后得到3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧胞苷(1.5克，63％的总产率)为白色粉末。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝2.28-2.38(m，1H)；2.65-2.74(m，1H)；3.62-3.68(m，2H)；4.35-4.40(m，1H)；4.95-5.00(m，1H)；6.20(d，J＝7.9Hz，1H)；6.25(dd，J＝6.9，7.0Hz，1H)；7.89(s，4H)；8.22(d，J＝7.9Hz，1H)；8.71(s，1H)；9.83(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝36.6；61.0；84.1；85.8；87.7；94.0；123.3；128.6；134.8；144.2；146.9；159.5；163.6.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2e)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺2′-脱氧胞苷(2c，375毫克，1.0毫摩尔)被溶解于甲胺的水溶液中(4％，11毫升，约12毫摩尔)。10分钟后，大部分的甲胺被真空条件下去除，其余的溶液用丙酮(2毫升)来处理。室温后3h，溶剂在真空条件下被除去，所得的残留物被溶解于水(30毫升)中。不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从0％到50％历时10分钟，在接下来的8分钟洗脱液B升到85％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝17分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2c，200毫克，71％，)为无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝1.83(s，3H)；1.84(s，3H)；1.99-2.09(m，1H)；2.30-2.39(m，1H)；3.55-3.66(m，2H)；4.02-4.06(m，1H)；4.65-4.70(m，1H)；5.30(br.s，1H)；5.77(d，J＝7.4Hz，1H)；6.17(dd，J＝5.6，8.7Hz，1H)；7.23(br.s，2H)；7.84(d，J＝7.4Hz，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝15.5；21.5；37.3；61.9；82.4；84.2；85.2；94.3；141.0；155.1；155.7；165.6.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2e)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷(2e，170毫克，0.6毫摩尔)的吡啶(2毫升)和二恶烷(1.5毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(150毫克，0.8毫摩尔)的二恶烷(1.5毫升)溶液。15分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，6毫升，1.2毫摩尔)和三丁基胺(0.7毫升，2.8毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(210毫克，0.8毫摩尔)，吡啶(16毫升)和水(0.32毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在30毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝14分)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从0％到70％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸，冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝7300Lmol^-1cm^-1)确定为225微摩尔(38％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.77(s，3H)；1.79(s，3H)；2.12-2.22(m，1H)；2.40-2.50(m，1H)；4.00-4.16(m，2H)；4.28-4.33(m，1H)；4.76-4.80(m，1H)；6.09(d，J＝7.7Hz，1H)；6.18(dd，J＝5.7，8.4Hz，1H)；7.23(br.s，2H)；7.96(d，J＝7.7Hz，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H3PO4＝0)＝-10.9(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-23.3(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧胞苷5′-三磷酸(2f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧胞苷-5′-三磷酸(2e，100微摩尔)的水溶液中(10毫升)加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(重量体积比为50％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系被水稀释(20毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(DionexBioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝16分钟)。冷冻干燥后产物2f为无色泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝7300Lmol^-1cm^-1)确定为74％。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.09-2.16(m，1H)；2.40-2.50(m，1H)；4.00-4.10(m，2H)；4.25-4.30(m，1H)；4.40-4.45(m，1H)；6.02(d，J＝6.5Hz，1H)；6.14(dd，J＝6.0，7.9Hz，1H)；7.85(d，J＝6.5Hz，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.2(br，1P)；-11.3(br，1P)；-22.9(br，1P).

例3.dATP-ONH₂的合成(图4)

5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3b)。

在5′-O-dimethoxytrity-2′-脱氧腺苷(3a，8.3克，15毫摩尔)，苯甲酸(3.0克，24毫摩尔)和三苯基膦(6.5克，24毫摩尔)的四氢呋喃(250毫升)溶液中，室温条件下加入DIAD(4.5毫升，24毫摩尔)。1小时后，加入甲醇(5毫升)来淬火反应。反应溶剂通过抽真空被去除。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有3％至5％的甲醇)得到3′-O-苯甲酰-5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(12克)为一种无色的泡沫。核磁共振显示，产品中包含一些三苯基膦氧化物以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被溶解在甲醇(300毫升)中，并用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，4毫升，21毫摩尔)处理。16小时后，在室温下，反应体系中加入醋酸(1.5毫升)。抽真空来去除溶液体系中的溶剂。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有3％到10％的甲醇)得到5′-O-Dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3.7克；45％的总产率)为无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝2.26-2.34(m，1H)；2.74-2.84(m，1H)；3.18-3.25(m，1H)；3.34-3.42(m，1H)；3.70-3.74(2s，6H)；4.17-4.22(m，1H)；4.31-4.36(m，1H)；5.95(d，J＝5.7Hz，1H)；6.35(dd，J＝1.0，7.8Hz，1H)；6.77-6.86(m，4H)；7.16-7.44(m，11H)；8.16(s，1H)；8.27(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝40.6；55.0；55.0；63.1；69.6；82.9；83.6；85.5；113.1；119.0；126.6；127.7；127.7；129.7；135.6；135.8；139.8；145.0；148.6；152.3；156.1；158.0；158.0.

3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧腺苷(3c)。

在5′-O-dimethoxytrityl-xylo-2′-脱氧腺苷(3b，3.4克，6毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(1.6克，10毫摩尔)和三苯基膦(2.6克，10毫摩尔)的四氢呋喃(120毫升)溶液中，在室温下加入DIAD(1.9毫升，10毫摩尔)。反应1小时后，用甲醇(3毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为95∶5)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl-3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧腺苷(6.2克)为无色的泡沫。根据核磁共振，含有大量的三苯基膦氧化物，以及一些消除产物(2′，3′-烯烃)。这些中间体被重新溶解在甲醇(30毫升)中，同时用浓盐酸的甲醇溶液(1.25摩尔，55毫升，约70毫摩尔)来处理。在室温下几分钟内，该产品开始沉淀。10分钟后，所得的固体被过滤，并在高真空下干燥，最后得到3c(1.5克，63％的总产率)为白色粉末。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝2.62-3.02(m，2H)；3.60-3.66(m，2H)；4.37-4.41(m，1H)；5.13-5.18(m，1H)；6.59(dd，J＝6.2，7.2Hz，1H)；7.91(s，4H)；8.58(s，1H)；8.78(s，1H)；8.97(br s，1H)；9.60(br s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝36.1；61.2；83.8；84.1；88.0；118.5；123.4；128.7；134.9；142.0；145.2；148.1；150.4；163.8.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(3e)。

3′-O-邻苯二甲酰亚胺2′-脱氧腺苷(3c，790毫克，2.0毫摩尔)被溶解于甲胺的水溶液中(4％，22毫升，约24毫摩尔)。20分钟后，大部分的甲胺被抽真空去除，其余的溶液用丙酮(3毫升)来处理。室温后3h，溶剂在抽真空条件下被除去，所得的残留物被溶解于水(35毫升)和己腈(15毫升)中。不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从25％到50％历时7分钟，在接下来的8分钟洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝14分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(465毫克，76％，)为无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝1.86(s，3H)；1.87(s，3H)；2.47-2.55(m，1H)；2.82-2.93(m，1H)；3.54-3.72(m，2H)；4.11-4.16(m，1H)；4.81-4.85(m，1H)；5.43(dd，J＝4.7，7.0Hz，1H)；6.33(dd，J＝5.9，8.9Hz，1H)；7.34(br.s，2H)；8.13(s，1H)；8.35(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝15.5；21.5；36.4；62.2；82.5；84.4；84.9；119.3；139.6；148.8；152.3；155.9；156.2.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷(3e，180毫克，0.6毫摩尔)的吡啶(2毫升)溶液，二恶烷(1.5毫升)和DMF(1毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(150毫克，0.8毫摩尔)的二恶烷(1.5毫升)溶液。15分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，6毫升，1.2毫摩尔)和三丁基胺(0.7毫升，2.8毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(210毫克，0.8毫摩尔)，吡啶(16毫升)和水(0.32毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在40毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝13分)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从0％到100％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸，冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝15400Lmol^-1cm^-1)确定为240微摩尔(40％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(s，3H)；1.83(s，3H)；2.55-2.78(m，2H)；3.97-4.13(m，2H)；4.32-4.37(m，1H)；4.90-4.95(m，1H)；6.33(dd，J＝5.8，9.0Hz，1H)；8.03(s，1H)；8.37(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-23.2(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧腺苷-5′三磷酸(3f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧腺苷-5′-三磷酸(100微摩尔)的水溶液中(10毫升)加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，2毫升，2毫摩尔)和羟胺的水溶液(重量体积比为50％，100微升，约1.6毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系被水稀释(20毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝15分钟)。冷冻干燥后产物3f为无色泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝15400Lmol^-1cm^-1)确定为65微摩尔(65％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.36-2.43(m，1H)；2.57-2.63(m，1H)；3.93-4.10(m，2H)；4.29-4.34(m，1H)；4.50-4.54(m，1H)；6.28(dd，J＝7.0，8.0Hz，1H)；8.04(s，1H)；8.33(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-8.8(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.2(d，J＝19.5Hz，1P)；-22.6(t，J＝19.5Hz，1P).

例4.dGTP-ONH2的合成(图5)

5′-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(4b)。

5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-2′-脱氧鸟苷(4a，9.4克，15毫摩尔)，苯甲酸(3.0克，24毫摩尔)和三苯基膦(6.5克，24毫摩尔)的四氢呋喃(250毫升)溶液中，室温条件下加入DIAD(4.5毫升，24毫摩尔)。0.5小时后，加入甲醇(2毫升)来淬火反应。反应溶剂通过抽真空被去除。所得的中间体被溶解在甲醇(600毫升)中，并用甲醇钠的甲醇溶液(5.3摩尔，7.6毫升，40毫摩尔)处理。16小时后，在室温下，反应体系中加入醋酸(2.3毫升，40毫摩尔)。抽真空来去除溶液体系中的溶剂。快速柱层析纯化(二氧化硅，洗脱梯度为二氯甲烷中含有0％到10％的甲醇)得到5′-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(5.6克；50％的总产率)为无色的泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝2.18-2.26(m，1H)；2.69-2.80(m，1H)；3.03(s，3H)；3.11(s，3H)；3.19-3.25(m，1H)；3.34-3.40(m，1H)；3.70-3.74(2s，6H)；4.16-4.20(m，1H)；4.32-4.37(m，1H)；5.57-5.61(m，1H)；6.29(dd，J＝1.5，8.4Hz，1H)；6.80-6.86(m，4H)；7.16-7.44(m，9H)；8.00(s，1H)；8.54(s，1H)；11.38(s，1H).¹³C-NMR(d₆-DMSO，75MHz)： (ppm)＝34.6；40.6；40.9；55.0；55.0；63.2；69.4；82.0；83.5；85.5；113.1；119.4；126.6；127.7；129.7；129.8；135.6；135.7；137.3；145.0；149.4；157.3；157.7；157.9；158.0；158.0.

5′-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰-2′-脱氧鸟苷(4c)

在5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-xylo-2′-脱氧鸟苷(4.7克，7.5毫摩尔)，N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2.1克，13毫摩尔)和三苯基膦(3.4克，13毫摩尔)的四氢呋喃(150毫升)溶液中，在室温下加入DIAD(2.5毫升，13毫摩尔)。反应1小时后，用甲醇(3毫升)来淬灭反应。反应溶剂用真空油泵被去除。快速柱层析(二氧化硅，淋洗液为二氯甲烷∶甲醇＝97∶3最后变为90∶105)分离纯化，得到了5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰亚胺-2′-脱氧鸟苷(5.3克)为无色的泡沫。根据核磁共振，含有约0.25当量的消除产物(2′，3′-烯烃)。部分的反应产物经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中，增加洗脱液B从50％到90％历时18分钟，在接下来，洗脱液B升到90％并保持6分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝22分钟)。冻干后最终得到一种无色的泡沫。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)： (ppm)＝2.64-2.74(m，1H)；2.84-2.94(m，1H)；3.09(s，3H)；3.16(s，3H)；3.31-3.45(m，2H)；3.75(s，6H)；4.56-4.61(m，1H)；5.12-5.16(m，1H)；6.53(dd，J＝5.5，8.6Hz，1H)；6.72-6.78(m，4H)；7.12-7.36(m，10H)；7.72-7.85(m，5H)；8.67(s，1H)；10.11(s，1H).¹³C-NMR(CDCl₃，75MHz)： (ppm)＝35.3；41.5；55.3；63.6；82.6；83.6；86.7；88.7；113.3；120.4；123.9；127.0；128.0；128.1；128.7；130.0；130.1；135.0；135.5；135.9；144.4；150.4；157.1；158.5；158.6；158.6；164.0.

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(4e)。

在5′-O-dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethylidene-3′-O-邻苯二甲酰-2′-脱氧鸟苷(4C，900毫克，约1毫摩尔邻苯二甲酰化合物，包含约0.25当量的2′，3′--烯烃)的甲醇(7毫升)溶液中加入浓盐酸(0.4mL，约5毫摩尔)和TFA(0.1毫升，约1.5毫摩尔)。混合物在室温下搅拌5分钟后得到均相的溶液。反应体系中加入浓氨水(30％，5毫升，约80毫摩尔)后所产生的悬浮液被搅拌1小时。接下来在加入甲胺的水溶液(10％，13毫升，约36毫摩尔)20分钟后，大部分的甲胺被抽真空去除，其余的溶液用盐酸中和，同时加入丙酮(3毫升)和己腈(5毫升)来处理。室温后3h，反应混合物中加入水(20毫升)和己腈(20毫升)，不溶解的固体在反相高效液相色谱之前被过滤净化(0.2微米)，反相高效液相色谱法的条件(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝乙腈，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从25％到50％历时5分钟，在接下来的12分钟洗脱液B升到80％，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝13分钟)。冷冻干燥后得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(120毫克，37％，)为无色泡沫。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝1.84(s，3H)；1.85(s，3H)；2.41-2.50(m，1H)；2.62-2.72(m，1H)；3.52-3.64(m，2H)；4.02-4.08(m，1H)；4.74-4.78(m，1H)；5.05-5.12(m，1H)；6.09(dd，J＝5.7，8.9Hz，1H)；6.51(br.s，2H)；7.95(s，1H)；10.60(br.s，1H).

3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷(100毫克，0.3毫摩尔)的吡啶(1毫升)溶液，二恶烷(0.8毫升)和DMF(1毫升)的溶液中，在室温下，加入2-氯-4H-1-1，3，2-benzodioxaphosphorin-4-one(75毫克，0.4毫摩尔)的二恶烷(0.75毫升)溶液。15分钟后，再加入tributylammonium pyrophosphate的DMF溶液(0.2摩尔，3毫升，0.6毫摩尔)和三丁基胺(0.35毫升，1.4毫摩尔)的混合物。20分钟后，再加入碘(100毫克，0.4毫摩尔)，吡啶(8毫升)和水(0.16毫升)。20分钟后，该反应被亚硫酸钠的水溶液(5％，0.5毫升)和丙酮(0.5毫升)淬灭。抽真空去除反应溶剂后，所得的残留物溶解在30毫升的水中，并用0.2微米的滤纸过滤。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，梯度从0％到25％的B历时16分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝16分钟)。接下来再经过反相高效液相色谱法纯化(Waters Prep Nova-Pak HR C18 column， 19×300毫米制备柱，洗脱液A＝25毫摩尔TEAA(pH值等于7)，洗脱液B＝50％的乙腈和洗脱液A，洗脱液的梯度为在洗脱液A中增加洗脱液B从0％到100％历时20分钟，洗脱液的流速＝5毫升/分钟，在这样的条件下，保留时间(RT)＝18分钟)。最终得到3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸，冻干后为一种无色的泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝11700Lmol^-1cm^-1)确定为135微摩尔(45％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝1.78(s，3H)；1.81(s，3H)；2.45-2.55(m，1H)；2.65-2.80(m，1H)；4.00-4.13(m，2H)；4.27-4.32(m，1H)；4.87-4.92(m，1H)；6.14(dd，J＝5.8，9.0Hz，1H)；7.98(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-9.7(d，J＝19.5Hz，1P)；-11.4(d，J＝19.5Hz，1P)；-23.1(t，J＝19.5Hz，1P).

3′-O-氨基-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(4f)。

在3′-O-(N-丙酮肟)-2′-脱氧鸟苷-5′-三磷酸(50微摩尔)的水溶液中(5毫升)加入醋酸钠的缓冲液(1摩尔，pH值4.0，1毫升，1毫摩尔)和羟胺的水溶液(重量体积比为50％，50微升，约0.8毫摩尔)。在室温下反应2h小时后，反应体系被水稀释

(10毫升)并过滤(0.2微米)。离子交换高效液相色谱仪纯化，色谱条件：(Dionex BioLC DNAPac PA-100，22×250毫米色谱柱，流动相洗脱液A＝水，洗脱液B＝1摩尔的NH₄HCO₃水溶液，洗脱梯度为流动相A中增加B的成分从0％到30％历时20分钟，流速＝10毫升/分钟，保留时间(RT)＝18分钟)。冷冻干燥后产物4f为无色泡沫。产率经由紫外线(260纳米，吸光系数＝11700Lmol^-1cm^-1)确定为36微摩尔(72％)。

¹H-NMR(D₂O，300MHz)： (ppm，rel to HDO＝4.65)＝2.50-2.75(m，2H)；3.97-4.13(m，2H)；4.29-4.34(m，1H)；4.55-4.60(m，1H)；6.08-6.16(m，1H)；8.00(s，1H).³¹P-NMR(D₂O，120MHz)： (ppm，rel to external H₃PO₄＝0)＝-10.6(br，1P)；-11.2(br，1P)；-23.0(br，1P).

例5.连接器组件的合成(图6)

(R，R)-Diacetyltartaric acid酸酐(5b)。在醋酸酐(12毫升)和细粉状酒石酸(5a，5.48克，36.6毫摩尔)的混合物中，室温条件下，在搅拌时加入浓硫酸(0.2毫升)。在释放出的热量停止后，该反应混合物被加热回流10分钟，然后逐渐冷却至0℃。所得的结晶产物被收集、过滤，并用甲苯洗涤。接下来，在0℃，这种粗产品在16毫升的乙醚中搅拌10分钟，过滤，并用乙醚洗涤，干燥后得到5.82克(74％)的酸酐(5b)。

(R，R))-N-Propragyl amine diacetyltartaric acid monoamide(5c).

在(R，R)diacetyltartaric acid酸酐(8.0克，34毫摩尔)的二氯甲烷(60毫升)溶液中，在氩气保护和0℃条件下，加入propragyl amine(2.3毫升，37毫摩尔)。在此条件下，反应混合物被搅拌过夜后，减压去除溶剂。所得固体被过滤，并用乙醚洗涤四次(每次50毫升)。高真空干燥后得到固体5c(8.0克)。

(R，R)-N-(Propragyl amine)-N′-N′-叔丁氧羰基乙二胺diacetyltartramide(5d).

二-N-琥珀酰亚胺草酸(1.7克，6毫摩尔)，monoamide 5c(2.3克，6.11毫摩尔)，乙腈(0.5毫升，6.11毫摩尔)和吡啶(100mL)的混合物，室温下在氩气的保护下，搅拌12小时。最终得到几乎是清亮的溶液，在0℃加入N-叔丁氧羰基乙二胺(961毫克，6.0毫摩尔)和三乙胺(0.8毫升，6.0mmol)的乙腈(15mL)的混合液。在0℃下该混合被搅拌1.5小时，然后加入乙酸乙酯(350毫升)和水(50毫升)。分离萃取，有机相用无水硫酸钠干燥。减压抽真空去除溶剂，所得的残留物经过制备硅胶柱(30克硅胶，洗脱液为CH₂Cl₂-MeOH(100∶7 v/v))纯化，得到淡黄色固体5d(2.0克)。

¹H NMR(CdCl₃∶Me₂SO-d₆，20∶1)：7.6(1H，br s，NH)，7.4(1H，br s，NH)，5.6(1H，s，NH)，5.544(1H，d，J＝3.8Hz，CH)，5.58(1H，d，J＝3.8Hz，CH)，3.79-4.1(2H，m，CH₂)，3.1-3.3(4H，m，CH₂)，2.1(1H，m，CH)，2.05(3H，s，CH₃)，2.07(3H，s，CH₃)，1.38(9H，s，CH₃)

例6.胸苷类似物与乙炔连接器和一个Cy3荧光标记(图7和8)

5′-Dimethoxytrityl-xylo-5-iodouridine(6c)

2′-deoxy-5-iodouridine(6a，5克；14.125毫摩尔)，三乙胺(2.35毫升；16.95毫摩尔)和N，N-二甲氨基吡啶(517毫克，4.23毫摩尔)的吡啶溶液(40毫升)被冷却到0℃。4，4′-dimethoxytrityl chloride(5.75克；16.95毫摩尔)的吡啶(40毫升)溶液被快速地加入，由此产生的混合物，经过一夜缓慢的升高到室温。接下来，反应体系被再次冷却至0℃，并加入三乙胺(6毫升；42毫摩尔)和甲基磺酰氯(2毫升；21毫摩尔)。得到的红色混合溶液的温度被升至室温。2小时后，悬浮液被过滤，得到的固体，用乙酸乙酯(100毫升)洗涤。滤液被合并，真空条件下浓缩后，得到6b为棕色泡沫。粗产品6b被重新溶解于乙醇(140毫升)和氢氧化钠水溶液(1M，70毫升；70毫摩尔)中。混合物被加热回流90分钟后，加入盐酸水溶液(1摩尔，40毫升，40毫摩尔)。乙醇在抽真空条件下被去除后，所剩余的残留物在二氯甲烷(100毫升)和盐水(20毫升)之间萃取。有机相用无水硫酸钠干燥。减压抽真空去除溶剂，所得的残留物经过制备硅胶柱(洗脱液为CH₂Cl₂中含有MeOH 0-5％)纯化，得到无色粉末(9克，99％)。

¹H-NMR(CDCl₃，300MHz)： (ppm)＝1.42(s，1H)；2.12-2.18(m，1H)；2.50-2.61(m，1H)；3.45-3.66(m，2H)；3.79(s，6H)；4.02-4.07(m，1H)；4.43-4.47(m，1H)；6.15(dd，J＝8.0，1.8Hz，1H)；6.84-6.88(m，4H)；7.20-7.46(m，9H)；8.25(s，1H).

3′-O-Phthalimidoyl-5-iodouridine(6e)

在化合物6c(9.5克；14.47毫摩尔)，三苯基膦(4.2克，16毫摩尔)和N-羟基邻苯二甲酰亚胺(2.6克；16mmol)的四氢呋喃(100毫升)溶液中，在0℃下，加入N，N′-二异丙基偶氮二(3.5毫升；18毫摩尔)。由此产生的橙色混合液经过一夜被为澄清同时温度升到室温。该混合物被水(0.6毫升)处理，溶剂在真空条件下被去除。经过快速柱层析(硅胶；洗脱液的梯度为50％乙酸乙酯和正己烷，最后为纯乙酸乙酯)，大部分的副产品被拆除，得到混合物(10克)其中大部分是6d(乙酸乙酯∶HEX＝2∶1；Rf＝0.37)，其余的是三苯基氧化膦。将上述的混合物悬浮在甲醇(750毫升)中，并用盐酸的水溶液(37.5毫升；约450毫摩尔)处理。得到清亮的溶液被冷却至-20℃，过夜后，得到6e为略带橙色的沉淀(1.83克；25％)。

¹H-NMR(d₆-DMSO，300MHz)： (ppm)＝2.29-2.39(m，1H)；2.56-2.60(m，1H)；3.64-3.67(m，2H)；4.28-4.32(m，1H)；4.90-5.00(m，1H)；5.29(t，J＝4.9Hz，1H)；6.30(dd，J＝8.3，5.8Hz，1H)；7.88(s，4H)；8.39(s，1H)；11.72(s，1H).

1-(5′-O-tert-Butyldiphenylsilyl-3′-O-phthalimidoyl-2′-deoxy-5-iodouracil(6f)

化合物6e(1.8克，3.66毫摩尔)在100mL圆底烧瓶中，与25毫升的甲苯在旋转蒸发仪上蒸发两次。然后加入无水DMF(25毫升)和咪唑(1.45克，21毫摩尔)。该混合物被搅拌，直到所有的咪唑被溶解。在氮气的保护下，加入Tert-butyldiphenylsilylchloride(2.2毫升，4.39毫摩尔)。然后将混合物在室温下搅拌过夜，用二氯甲烷稀释(100毫升)，并用水萃取三次(每50毫升)，饱和氯化钠水溶液(50毫升)洗涤一次。有机相用无水硫酸钠干燥，真空过滤，旋转蒸发浓缩。由此产生的残余物经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为正己烷∶乙酸乙酯＝1∶1，得到6f为白色固体(2.1克，81％)。

3′-O-Amino-1-(5′-O-tert-butyldiphenylsilyl-2′-deoxy-5-iodouracil(6g

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