专利摘要
本专利发明了一种库尔勒香梨果实果肉细胞计数方法，用番红‑固绿染色法，对常规石蜡切片法处理好的库尔勒香梨果实切片进行染色，然后在显微镜下观察单位面积内的细胞数目，通过基于果实切面面积基础上的换算方法，计算出库尔勒香梨果实果肉细胞数目，本专利方法能更准确地计算出库尔勒香梨果实果肉细胞数目，能为研究库尔勒香梨果实果肉细胞体积、果肉细胞数目与果实大小之间的关系提供更科学的计算方法。
权利要求
1.一种库尔勒香梨果实果肉部分细胞计数方法，其特征是先用游标卡尺测出库尔勒香梨果实半径R，库尔勒香梨梨核半径r，将库尔勒香梨果肉部分样品切成0.5cm*0.5cm*1cm小块后浸泡在FAA固定液中，用提前配制好的番红、固绿染液，对常规石蜡切片法处理好的库尔勒香梨果肉部分切片进行染色，经梯度酒精、二甲苯处理后，用中性树胶制作成永久切片，再在显微镜下观测单位面积内的细胞数目，其中在显微镜下选取库尔勒香梨果肉部分，计数一定面积S内的果肉细胞数目N，根据公式计算出库尔勒香梨果实果肉部分细胞数目，所述公式为，
所述面积S为：0.03cm
2.根据权利要求1所述的库尔勒香梨果实果肉部分细胞计数方法，其特征在于，将库尔勒香梨果实沿中心部分横向切开，从中心向外依次测出库尔勒香梨梨核半径r，库尔勒香梨果实半径R。
3.根据权利要求1所述的库尔勒香梨果实果肉部分细胞计数方法，其特征在于，所述FAA固定液，第2天更换一次，第4天更换一次，第7天更换一次，第15天更换一次，然后将样品保存在4±0.5℃冰箱内。
4.根据权利要求1所述的库尔勒香梨果实果肉部分细胞计数方法，其特征在于，所述制作成永久切片过程为：用50％乙醇溶液浸洗固定好的库尔勒香梨果肉组织30min→依次用65％乙醇、80％乙醇、90％乙醇、95％乙醇、100％乙醇浸泡1.5h→分别在乙醇和二甲苯体积比例依次为2∶1，1∶1，1∶2的混合溶液中各浸泡1h→纯二甲苯中浸泡2h→在40℃烘箱中，用二甲苯和石蜡质量比为1∶1的混合溶液中浸泡12h→在60℃烘箱中浸蜡，每天更换两次干净的蜡液，一共更换6次→用常规石蜡切片法将库尔勒香梨果肉切成10μm厚→贴片→脱蜡→番红固绿复染→中性树胶封片。
说明书
技术领域
本专利发明了一种库尔勒香梨果实果肉细胞计数方法，用番红-固绿染色法，对常规石蜡切片法处理好的库尔勒香梨果实切片进行染色，然后在显微镜下观察单位面积内的细胞数目，通过基于果实切面面积基础上的换算方法，计算出库尔勒香梨果实果肉细胞数目，本专利方法能更准确地计算出库尔勒香梨果实果肉细胞数目，能为研究库尔勒香梨果实果肉细胞体积、果肉细胞数目与果实大小之间的关系提供更科学的计算方法。
背景技术
梨（Pyrus spp）属于蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pomoideae）梨属（Pyrus.L）植物，共有30多个种，是继葡萄和苹果后，世界上第三大温带水果品种，有3 000多年的栽培历史。Baile根据梨属植物的原生分布，将其划分为两类，一类为西方梨，或称欧洲梨（European pear），也称西洋梨，起源于地中海和高加索地区，主要分布于欧洲、北美洲、南美洲、非洲及大洋洲；另一类为东方梨，也称亚洲梨（Asian pear），起源于我国，主要分布在中国、日本、韩国等亚洲国家。我国为世界第一产梨大国，依据美国农业部对外农业服务局公布统计的数据显示：2012-2013年度，中国梨的产量为165 000万吨，占世界梨总产量的75%，其中出口4 400万吨，占世界梨出口总量的25%左右。库尔勒香梨是新疆有名的特色水果，原产于新疆库尔勒地区，为鸭梨和瀚海梨的天然杂交种，有1 400多年的栽培历史。库尔勒香梨具有皮薄肉脆，细嫩多汁，清甜爽口，含糖量高等特点，维生素C含量丰富且耐贮藏，尤以气味芳香最为独特。曾在国内多次获奖，在国际市场上享有‘果中之王’、‘梨中珍品’、‘中华蜜梨’、‘梨后’、‘梨中王子’等美誉，通过多年的发展，库尔勒香梨产业已经成为当地农业经济发展的支柱产业，也是农民摆脱贫困，增加收入的主要渠道，更是出口创汇的重要农产品，国内外市场所占份额越来越大，产品远销日本、新加坡、泰国、加拿大等十多个国家和地区，深受国内外消费者的喜爱。
但库尔勒香梨具有果实偏小，果肉部分相对较小，果心部分所占比例较大的缺点。本特色果树研究中心在前期研究中发现，植物器官间大小的个体差异是由控制该器官特异基因表达水平变化而引起的。库尔勒香梨果实大小主要是由细胞体积与细胞数目共同决定的。继成功授粉后，果实膨大主要取决于细胞分裂和细胞膨大，这两个过程共同决定了库尔勒香梨果实的最终体积。而国内科研工作者在研究库尔勒香梨果肉组织细胞体积、数目时，所采用的方法是纵横经测量法，误差较大，不能满足科研需要，本实验发明了一种基于果实切面面积基础上的细胞计数方法，可用于不同时期库尔勒香梨梨果肉组织细胞体积、数目测定，为研究库尔勒香梨果肉细胞体积、细胞数目与梨果实大小之间的关系提供更科学的计算方法。
发明内容
针对库尔勒香梨果实相对较小，可食用果肉部分较少，果心部分过大特点，本发明创造发明了一种库尔勒香梨果实果肉细胞计数方法，可用于分析影响库尔勒香梨果实大小的主要原因的研究中。本专利方法具有以下优点:1.本发明方法是在库尔勒香梨果实切面面积基础上进行的细胞计数方法，比传统的细胞纵横径测量方法更科学。2.本发明方法避免了流式细胞法的取样不均匀、不易分离细胞的繁琐操作步骤，具有操作简便，对染色时间要求不严格的特点。3.本发明方法能更准确地定位果肉层细胞，更大程度上避免表皮细胞和维管束细胞的干扰，又能将石细胞的影响减到最小。4.本发明方法能将果肉细胞染成蓝色，石细胞和疏导组织细胞染成黑色，具有立体染色效果。5.本发明方法节约时间和材料，不需要载玻片即可直接观察，也可制作成永久切片，用于教学、科学研究中。
具体实施方法
1 切割样品 将库尔勒香梨果实沿中心部分横向切开，并用游标卡尺从中心向外依次测出库尔勒香梨梨核部分半径为r，库尔勒香梨果实半径为R。2 样品固定：将库尔勒香梨果肉部分切成0.5cm*0.5cm*1cm的小块，固定在FAA固定液中，第2天更换一次固定液，第4天更换一次固定液，第7天更换一次固定液，第15天更换一次固定液，然后将样品保存在4±0.5℃冰箱内（FAA固定液配制方法是70%无水酒精:冰乙酸:40%甲醛溶液=90:5:5）。3 试剂：番红溶液，将1.2g番红溶入100ml 50%乙醇溶液中，过滤后备用；固绿溶液，将0.4g固绿溶入100ml 95%乙醇溶液中，过滤后备用。4 操作步骤：（1）石蜡切片制作 用50%乙醇溶液浸洗固定好的库尔勒香梨果肉组织30min→依次用65%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇浸泡1.5h→分别在乙醇和二甲苯体积比例依次为2∶1，1∶1，1∶2的混合溶液中各浸泡1h→纯二甲苯中浸泡2h→在40℃烘箱中，用二甲苯和石蜡质量比为1∶1的混合溶液中浸泡12 h→在60℃烘箱中浸蜡，每天更换两次干净的蜡液，一共更换6次→用常规石蜡切片法将库尔勒香梨果肉切成10μm厚→贴片→脱蜡→染色（番红固绿复染）→中性树胶封片。（2）果肉细胞数目计算 在显微镜下选取库尔勒香梨果肉部分，计数一定面积S（0.03cm2<S<0.05cm2）内的果肉细胞数目N（单位面积边界处的细胞运用四舍五入计数法计数，大部分在单位面积内的记作1，小部分在单位面积内的记作0)。则单个细胞的平均面积S（均）=S/N，已知库尔勒香梨果实半径为R，梨核部分半径为r，则所测库尔勒果实果肉细胞数目为：
一种库尔勒香梨果实果肉细胞计数方法专利购买费用说明
Q：办理专利转让的流程及所需资料
A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。
1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。
2：按规定缴纳著录项目变更手续费。
3：同时提交相关证明文件原件。
4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。
Q:专利著录项目变更费用如何缴交
A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式
Q：专利转让变更，多久能出结果
A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。
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