专利摘要

本发明涉及制药领域，具体涉及一种改进的雷公藤甲素‑适配子偶合物的合成方法，本发明所述方法包括：1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸烯丙酯；2)3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉作用下生成3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸；3)3‑(14‑雷公藤甲素氧基)‑丙烯酸在含水的有机溶剂中并在EDCI‑NHS和N‑羟基琥珀酰亚胺作用下与溶于缓冲溶液中的适配子反应生成适配子‑雷公藤甲偶合物。本发明方法减少了副反应的发生、提高了适配子的利用率，使得工艺更加简单、优化、更环保，从而提高了目的产物的产率。

权利要求

1.一种改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括：

1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯；

2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉的作用下生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸；

3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸在含水的有机溶剂中并在EDCI-NHS和N-羟基琥珀酰亚胺的作用下与溶于碱性缓冲溶液中的适配子反应生成适配子-雷公藤甲偶合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中三丁基膦的量为0.1～1.0当量；丙炔酸烯丙酯的量为1～2.0当量；有机溶剂的量为5～25mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、1，1-二氯乙烷或二甲苯、或它们的任意组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量；吗啉的量为2～10当量；有机溶剂的量为10～40mL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中有机溶剂为四氢呋喃、甲苯，1，4二氧六环或二甲基亚砜，或它们的任意组合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中EDCI-NHS的量为1.1～2.0当量；N-羟基琥珀酰亚胺的量为1.1～2.0当量；有机溶剂的量为2～5mL；水的量为0.7～1.4mL；碱性缓冲溶液的量为1～4mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或乙腈、或它们的任意组合。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)进一步包括：反应结束后加入40～70mL的水，用三次25mL的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)进一步包括：反应结束后减压除去四氢呋喃，加入40～70mL的水，用三次25mL的乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸。

10.根据权利要求1-9任一所述的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法，其特征在于，所述方法包括：

1)在三口圆底烧瓶中加入5～25mL二氯甲烷，1当量的雷公藤甲素，1～2.0当量，优选1.1～1.3当量的丙炔酸烯丙酯和0.1～1.0当量、优选0.2～0.3当量的三丁基膦，温度保持在20～30℃搅拌反应4h后，加入的水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。

2)在单口圆底烧瓶中加入10～40mL四氢呋喃，1当量的3-(14-雷公藤甲素基氧基)-丙烯酸烯丙酯，2～10当量，优选4～5当量的吗啉和0.1～1.0当量、优选0.1～0.2当量四三苯基膦钯，在氮气保护的条件下，温度保持在20～30℃搅拌过夜反应后，减压除去四氢呋喃，加入的水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸。

3)将1当量的3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸溶于2～5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入溶于0.7～1.4mL ddH₂O的1.1～2.0当量、优选1.1～1.3当量EDCI-NHS与1.1～2.0当量、优选1.1～1.3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，保持混合物反应温度在30～40℃，振荡反应2小时后，将0.004～0.01当量的适配子溶于1～4mL的pH＝7.8的碳酸钠/碳酸氢钠的缓冲液中并将其加入前面的反应液中，避光反应24小时，反相制备柱纯化，冷冻干燥得到适配子-雷公藤甲素偶合物。

说明书

技术领域

本专利涉及医药化工技术领域，具体涉及适配子-雷公藤甲素偶合物合成工艺的优化。

背景技术

雷公藤甲素(Triptolide，TP)又名雷甲素是从传统中药雷公藤中分离得到的环氧化二萜内酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其为白色晶体，不溶于水，易溶于多种有机溶剂。雷公藤甲素是具有松香烷骨架的二萜化合物，含有三个环氧结构和一个α、β不饱和五元内酯环，雷公藤甲素具有抗炎、免疫抑制、抗生育抗肿瘤等诸多活性，广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎和肿瘤等。研究表明，雷公藤甲素是一种广谱肿瘤抑制剂，体外可诱导多种肿瘤细胞的凋亡，包括卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、口腔癌、胃癌等，体内可抑制肿瘤生长和肿瘤细胞转移，包括血液学肿瘤、恶性肿瘤、实体瘤。雷公藤甲素抗肿瘤活性优于顺铂、阿霉素、紫杉醇等传统的抗癌药物，在极低浓度(2-10ng/ml)下即可有效抑制肿瘤细胞增殖。除此之外，雷公甲素还可对抗肿瘤耐药，并提高肿瘤细胞对其他抗癌药物的敏感性、与化疗药物和电离辐射相结合发挥协同效应。

适配子(aptamer)是一类具有治疗作用的寡核苷酸，能与靶蛋白发生特异性、高亲和力的结合，其功能类似单克隆抗体，具有高亲和力和高特异性；由于分子量小，可通过细胞膜进入细胞内，能更方便地富集到体内靶向部位；且在体内半衰期长，稳定性好，对环境温度不敏感，容易保存、合成 和修饰，可提高其在临床诊断和治疗中的应用。适配子可直接作为药物治疗疾病，部分适配子在与其对应的靶序列特异结合时，结合位点为蛋白的功能区域，蛋白功能将会被抑制。适配子还可作为药物运输载体，将药物与适配子相连使之具有细胞选择性，避免对正常组织和细胞的毒副作用。

已知的适配子例如AS1411、Sgc8c，其中AS1411可与肿瘤细胞表面高表达的核仁素特异性结合，同时膜表面的核仁素又能促进肿瘤细胞对AS1411的大胞饮作用，增加摄取量；Sgc8c是通过以完整细胞为靶的指数富集的配基系统进化技术(cell-SELEX)筛选得到的特异性靶向急性T淋巴细胞白血病的单链DNA适配子，由于其血清稳定性高、特异性强和免疫原性低等优势，Sgc8c作为靶向配体与化疗药物相偶联，在急性T淋巴细胞白血病的治疗上取得了很好的效果。

因此可以将雷公藤甲素及其结构修饰物与适配子进行结合以提高雷公藤甲素及其结构修饰物的抗肿瘤生物特性。WO2015/085447公开了雷公藤甲素衍生物及其合成方法，其所得的适配子-雷公藤甲素偶合物为白色粉末状固体，即将适配子与雷公藤甲素通过化学小分子的方式链接而形成的适配子雷公藤甲素偶合物(aptamer-drug conjugate，ADCs)，从而利用适配子介导雷公藤甲素到达特定的器官、组织甚至细胞，与细胞膜上受体结合，引发受体介导的内吞作用，从而提高其在靶组织/靶细胞的浓度。

WO2015/085447涉及到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯合成反应时采用了Michael加成反应，如实施案例3涉及到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯合成反应，该反应中使用N-甲基吗啉，可能会在反应过程中引起丙炔酸烯丙酯自身加成。

发明内容

针对以上技术情况，本发明提供一种改进的适配子-雷公藤甲素偶合物制备方法。本发明改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法包括：

1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在有机溶剂中于三丁基膦作用下反应生 成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯；

2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯于有机溶剂中在四三苯基膦钯和吗啉作用下生成3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸；

3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸在含水的有机溶剂中并在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI-NHS)和N-羟基琥珀酰亚胺作用下与溶于碱性缓冲溶液中的适配子反应生成适配子-雷公藤甲偶合物。

本发明方法所述步骤1)中，作为本发明实施方案之一，三丁基膦的量为0.1～1.0当量，优选0.2～0.3当量；作为本发明实施方案之一，丙炔酸烯丙酯的量为1～2.0当量，优选1.1～1.3当量；作为本发明实施方案之一，有机溶剂的量为5～25mL。

本发明方法所述步骤1)中，作为实施方案之一有机溶剂为二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、1，4二氧六环、乙腈、1，1-二氯乙烷或二甲苯、或它们的任意组合。

本发明方法所述步骤2)中，作为本发明实施方案之一，四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量；作为本发明实施方案之一，吗啉的量为2～10当量，优选4～5当量；作为本发明实施方案之一，四三苯基膦钯的量为0.1～1.0当量，优选0.1～0.2当量；作为本发明实施方案之一，有机溶剂的量为10～40mL。

本发明方法所述步骤2)中，作为本发明实施方案之一，有机溶剂为四氢呋喃、甲苯，1，4二氧六环或二甲基亚砜、或它们的任意组合物。

本发明方法所述步骤3)中，作为本发明实施方案之一，EDCI-NHS的量为1.1～2.0当量，优选为1.1～1.3当量；作为本发明实施方案之一，N-羟基琥珀酰亚胺的量为1.1～2.0当量，优选为1.1～1.3当量；有机溶剂的量为2～5mL，作为本发明实施方案之一，水的量为0.7～1.4mL；作为本发明实施方案之一，碱性缓冲溶液为1～4mL；作为实施方案之一，所述碱性缓冲溶液为pH＝7.8的碳酸钠/碳酸氢钠的缓冲液。

本发明方法所述步骤3)中，作为本发明实施方案之一，有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈、或它们的任意组合。

作为本发明实施方案之一，所述步骤1)进一步包括：反应结束后加入的40～70mL，优选50mL水，用三次25mL的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。

作为本发明实施方案之一，所述步骤2)进一步包括：反应结束后减压除去四氢呋喃，加入40～70mL，优选50mL的水，用三次25mL的二乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸。

作为本发明实施方案之一，本发明方法不仅仅适用于雷公藤甲素，还包括WO2015/085447所公开的其他雷公藤甲素类似物。

作为实施方式之一，本发明方法不仅适用于AS1411或Sgc8c的适配子，还包括其他末端为氨基修饰的所有适配子均可以用于本发明中。

本发明方法中以上各原辅料的当量数及溶剂用量均为在以1当量的雷公藤甲素的用量为基础下的使用量。

作为本发明实施方案之一，本发明方法包括如下步骤：

1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在乙腈中反应的反应式如下：

2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯脱去烯丙酯的反应式如下：

3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸与适配子反应的反应式如下：

(注：带氨基的带状物为适配子)

作为本发明实施方案之一，所述改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法包括：

1)在三口圆底烧瓶中加入5～25mL二氯甲烷，雷公藤甲素(1当量)，丙炔酸烯丙酯(1～2.0当量，优选1.1～1.3当量)和三丁基膦(0.1～1.0当量，优选0.2～0.3当量)，在温度保持在20～30℃条件下搅拌反应4h后，加入的水，二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，柱层析处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯。

2)在单口圆底烧瓶中加入10～40mL四氢呋喃，3-(14-雷公藤甲素基氧基)-丙烯酸烯丙酯(1当量)，吗啉(2～10当量，优选4～5当量)和四三苯基膦钯(0.1～1.0当量，优选0.1～0.2当量)，在氮气保护的条件下，温度保持在20～30℃搅拌过夜反应后，减压除去四氢呋喃，加入的水，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥后除去有机溶剂，处理得到3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯 酸。

3)将1当量的3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸溶于2～5mL N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入溶于0.7～1.4mL ddH₂O的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(1.1～2.0当量，优选1.1～1.3当量)与N-羟基琥珀酰亚胺(1.1～2.0当量，优选1.1～1.3当量)的溶液，混合物振荡反应2小时后，再将0.004～0.01当量的适配子溶于1～4mL的pH＝7.8的碳酸钠/碳酸氢钠的缓冲液中，溶解后将其加入前面的反应液中，避光温度保持在30～40℃反应24小时，反相制备柱纯化，冷冻干燥得到适配子-雷公藤甲素偶合物。

本发明所述方法各步骤中所涉及的柱层析及反相制备均为本领域常规的方法，本领域技术人员结合本领域常识及本发明记载内容即可确定。

本发明所述方法针对雷公藤甲素进行Michael加成反应中主要使用的是碱，以三丁基膦代替N-甲基吗啉；本发明未使用N-甲基吗啉，避免了在反应过程中引起丙炔酸烯丙酯自身加成反应形成；同时3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸与AS1411缩合时，使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI-NHS)，首先将酸转换为活性酯，提高适配子AS1411的利用率；同时本发明进一步优化了其他的工艺条件。本发明方法减少副反应的产生、提高了适配子的利用率，从而简化纯化工艺、提高了产率可使产率能达到58％以上。

附图说明

图1：AS1411-雷公藤甲素偶合物的质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

本发明的雷公藤甲素-AS1411的合成路线如下

1)雷公藤甲素与丙炔酸烯丙酯在乙腈中反应的反应式如下：

2)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯脱去烯丙酯的反应式如下：

3)3-(14-雷公藤甲素氧基)-丙烯酸与适配子反应的反应式如下：

在50ml的三颈圆底烧瓶上安装恒压滴液漏斗，加入10ml的二氯甲烷，将1.8g(5mmol)的雷公藤甲素溶于其中，然后加入0.66g(6.0mmol)的丙炔酸烯丙酯，在搅拌的条件下，通过恒压滴液漏斗将5ml的溶有0.202g(1mmol)的三丁基膦的二氯甲烷溶液缓慢滴加到反应瓶中，在常温条件下继续反应4h，通过LC-MS监测反应，当雷公藤甲素完全消失后，停止反 应。然后加入50ml的水，用三次25ml的二氯甲烷洗涤水相，合并有棚目，再用5ml饱和食盐水洗涤有机相三次，加入无水硫酸钠干燥有机相，抽滤后减压除去二氯甲烷，得到淡黄色油状物，再通过快速色谱柱分离得到1.41g白色固体的目标产物3-(雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯，产率为60％，相对原来的方法提高了10％。

在50ml的单口圆底烧瓶中加入10ml的四氢呋喃，将0.94g(2mmol)的3-(雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯溶于其中，然后依次加入0.87g(10mmol)的吗啉和0.23g(0.2mmol)四三苯基膦钯，在氮气保护的条件下，室温中搅拌过夜反应，通过LC-MS监测反应，当3-(雷公藤甲素氧基)-丙烯酸烯丙酯完全消失后，停止反应。减压条件下除去四氢呋喃，然后加入50ml的水，用三次25ml的乙酸乙酯洗涤水相，合并有机相，再用5ml饱和食盐水洗涤有机相三次，加入无水硫酸钠干燥有机相，抽滤后减压除去乙酸乙酯，得到淡黄色油状物，再通过快速色谱柱分离得到0.28g白色固体的目标产物3-(雷公藤甲素氧基)-丙烯酸，产率为33％。

将32.3mg(75μmol)的3-(雷公藤甲素氧基)-丙烯酸溶于3ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入溶于1ml的ddH₂O的15.28mg(80μmol)的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐与9.2mg(80μmol)的N-羟基琥珀酰亚胺溶液，将混合物搅拌反应2h，再将适配子AS1411(4.24mg，0.5μmol)溶于2.5ml，pH＝7.8的碳酸钠/础酸氢钠的缓冲液中，不断振荡，使其完全溶解后将其加入前面的反应液中，常温条件下避光反应24小时，通过高效液相检测反应进程，当反应完全后，利用反相制备柱纯化，将所收集的含有目标产物的溶液用冷冻干燥的方法得到2.52mg的AS1411-雷公藤甲素偶合物(参见图1)，产率为58％，相对原来的方法提高了13％。

MS：calculated 8896.0(found 8895.9)。

一种改进的雷公藤甲素-适配子偶合物的合成方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。