甾体化合物侧链修饰基因及其应用

IPC分类号 : C12N9/02,C12N9/04,C12N9/16,C12N15/53,C12N15/55,C12P33/20,C12P33/00

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CN201810335957.X

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专利摘要

本发明属于基因工程和生物合成领域，特别涉及甾体化合物的生物合成。本发明提供了在绿胶霉素类化合物合成中对侧链断裂具有关键作用的基因，分别命名为VidF、VidP和VidH及其编码多肽。所述多肽序列如SEQIDNO：1‑3所示；所述核苷酸序列如SEQIDNO：4‑6所示。

权利要求

1.一种分离的多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO:1所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:4所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

(b)SEQ ID NO:2所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:5所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

(c)SEQ ID NO:3所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:6所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列。

2.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1所述的多肽，优选的，所述多核苷酸包含：

(i)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(iii)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列。

3.表达盒，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸。

4.载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的表达盒。

5.细胞，包含权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体，所述细胞优选为真菌细胞，例如米曲霉细胞，更优选为多节孢属真菌，例如NodulisporiumSp.(65-12-7-1)。

6.一种绿胶霉素类化合物的合成方法，其包括将权利要求1所述的多肽或者权利要求1中至少两组所述多肽的组合与甾体化合物底物接触，优选的，所述甾体化合物底物在C17位连接有结构的侧链；例如，所述甾体底物的结构如下式所示：

7.一种催化甾体化合物C17-C20位键断裂的方法，其包括将权利要求1所述的多肽或者权利要求1中至少两组所述多肽的组合与甾体化合物接触，优选的，所述甾体化合物在C17位连接有结构的侧链；例如，所述甾体化合物为孕酮或孕烷，或者所述甾体化合物的结构如下式所示：

8.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达盒、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的细胞在绿胶霉素类化合物合成中的用途。

9.权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达盒、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的细胞在催化甾体化合物C17-C20位键断裂中的用途。

10.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的多肽、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的表达盒、权利要求4所述的载体或权利要求5所述的细胞。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物合成领域，特别涉及甾体化合物的生物合成。

背景技术

自1945年绿胶霉素被发现以来(Brian,P.W.&McGowan.,J.C.Viridin:a highlyfungistatic substance produced by Trichoderma viride.Nature 156,144-145(1945))，大量研究表明这类化合物具有光谱的抗真菌作用，抗炎作用以及抗细菌活性，特别地，还发现他们是纳摩尔级别的PI3K基酶抑制剂，其中渥曼青霉素已经发展成为一种商业的PI3K抑制剂被广泛使用。由于信号分子PI3K在肿瘤方面的重要作用，绿胶霉素类化合物作为PI3K抑制剂已被发现具有重要的抗肿瘤活性，其中渥曼青霉素半合成类似物PX-886作为抗肿瘤药物最近已经进入II期临床研究。由于这类化合物结构特殊，活性多样，已经引起人们的广泛关注。经过过去20年期间不断开展的对呋喃甾体类化合物的全合成研究，已于2017年全合成了渥曼青霉素、左旋绿胶霉素以及左旋绿毛菌醇。然而相比于化学合成，生物合成研究却一直未有实质性进展。

自上世纪60年代开始，人们便开始对绿胶霉素类化合物的生物合成机制展开研究。通过喂养同位素标记的化合物mevalonate或者acetate，首次证明了绿胶霉素不是来自二萜途径，而是源于甾体(Grove,J.F.Viridin.Part VI.Evidence for a steroidalpathway in the biogenesis of viridin from mevalonic acid.J.Chem.Soc.C.,549-551(1969)；Hanson,J.R.&Wadsworth,H.J. Biosynthesis ofdemethoxyviridin.J.Chem.Soc.,Chem.Commun.,360-361.(1979)；Simpson,T. J.,Lunnon,M.W.&MacMillan,J.Fungal products.Part 21.Biosynthesis of the fungalmetabolite,wortmannin,from[1,2-13C2]-acetate.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,931-934. (1979))。随后，Golder等人通过喂养14C标记的羊毛甾醇，证明绿胶霉素化合物的生物合成前体和麦角甾醇一样都是羊毛甾醇(Golder,W.S.&Watson,T.R.Lanosterolderivatives as precursors in the biosynthesis of viridin.Part 1.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,422-425(1980))。 Hanson等人从产去甲氧绿胶霉素的菌株中进一步发现了一系列麦角甾醇侧链衍生物C6和 C7醇，证明了在去甲氧绿胶霉素生物合成过程中，甾醇侧链断裂发生在C20和C22之间 (Hanson,J.R.,O'Leary,M.A.&Wadsworth,H.J.Fungalcleavage of the sterol side chain.J. Chem.Soc.,Chem.Commun.,853-854(1980)；Hanson,J.R.,O'Leary,M.A.&Wadsworth,H.J. Studies of terpenoidbiosynthesis.Part 29.The cleavage of the sterol side chain in thebiosynthesis of demethoxyviridin.J.Chem.Soc.,Perkin Trans.1,871-873(1983))。这些结果充分说明了绿胶霉素类化合物是从麦角甾醇生物合成途径分支而来。不过，在绿胶霉素类化合物的生物合成机制研究中，仍然存在多个关键问题没有解决，特别是在C17位的侧链断裂修饰的反应机制和关键基因，从而大大限制了绿胶霉素类化合物的生物合成。因此本领域迫切需要鉴定出在绿胶霉素类化合物的生物合成过程中，能够促进甾醇的侧链断裂的关键基因。

发明内容

发明人经过多年的研究，分离获得了在绿胶霉素类化合物合成中对侧链断裂具有关键作用的基因，分别命名为VidF、VidP和VidH。这三个基因能够有效的催化真菌体内绿胶霉素类化合物的合成过程中甾体化合物的第17位碳与侧链20位碳之间之间连接键的断裂和/或修饰，从而促进绿胶霉素类化合物合成的进行。这也是本领域首次分离出能够催化绿胶霉素类化合物合成途径中C17-C20断裂的基因。

本发明的第一个方面提供了一种分离的多肽，其包含：

(a)SEQ ID NO:1所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选80％、85％、 90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:4所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、 90％、93％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

(b)SEQ ID NO:2所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、 85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:5所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、 90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列；和/或

(c)SEQ ID NO:3所示的多肽序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、 85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的多肽序列；或者

由SEQ ID NO:6所示的核酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、85％、 90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列编码的多肽序列。

本发明的第二方面提供了一种编码第一方面多肽的分离的多核苷酸，

在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含：

(i)SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、 85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(ii)SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、 85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列；和/或

(iii)SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列或者与其具有至少70％序列同一性，优选具有80％、 85％、90％、93％、95％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列。

本发明的第三个方面提供了一种表达盒，其包含根据本发明第二方面的多核苷酸。

本发明的第四个方面提供了一种载体，如表达载体，其包含了本发明第二方面所述的多核苷酸或第三方面所述的表达盒。

本发明的第五个方面提供了一种细胞，包含本发明第二方面的多核苷酸、第三方面的表达盒或第四方面的所述的载体。

在一个实施方案中，所述细胞为真菌细胞。

在一个优选的实施方案中，所述细胞为多节孢属真菌，例如Nodulisporium Sp.(65-12-7-1)，在另一个优选的实施方案中，所述细胞为米曲霉细胞

在一个实施方案中，所述细胞为细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。

本发明的第六方面提供了一种绿胶霉素类化合物的合成方法，其包括将本发明第一方面的任一组多肽、任选两组或者三组多肽的组合与甾体化合物底物接触。

在一个实施方案中，所述甾体化合物底物在C17位连接有结构的侧链；

在一个优选实施方案中，所述甾体化合物底物是3-Dihydrovirone，其结构如下式所示：

其中优选的，所述甾体化合物底物是绿胶霉素类化合物的天然合成过程中的底物，更优选的，所述底物是已经发生了C20-C22碳链断裂后的底物。

本发明的第七方面提供了一种催化甾体化合物C17-C20位键断裂的方法，其包括将本发明第一方面的任一一组多肽、任选两组或者三组多肽的组合与甾体化合物接触，

在一个实施方案中，所述甾体化合物在C17位连接有结构的侧链；

在一个具体实施方案中，所述甾体化合物是3-Dihydrovirone

在另一个具体实施方案中，所述甾体化合物为孕烷；

在另一个具体实施方案中，所述甾体化合物是孕酮。

在又一个实施方案中，所述甾体化合物是绿胶霉素类化合物的天然合成过程中的底物，更优选的，所述化合物已经发生了C20-C22碳链断裂。

本发明的第八方面提供了本发明第一方面的多肽、第二方面的多核苷酸、第三方面的表达盒、第四方面的载体或第五方面的细胞在绿胶霉素类化合物合成中的用途。

本发明的第九方面提供了本发明第一方面的多肽、第二方面的多核苷酸、第三方面的表达盒、第四方面的载体或第五方面的细胞在催化甾体化合物C17-C20位键断裂中的用途。

本发明的第十方面提供了一种试剂盒，其包含本发明第一方面的多肽、第二方面的多核苷酸、第三方面的表达盒、第四方面的载体或第五方面的细胞。

附图说明

图1a显示了渥曼青霉素(wortmannin)，绿胶霉素(viridin)和去甲氧绿胶霉素(demethoxyviridin)的结构；图1b显示了本发明鉴定的来自Nodulisporium sp(65-12-7-1) 的去甲氧绿胶霉素合成基因簇。

图2显示了vid基因缺失突变体的代谢物分析。图上部是来自vid基因缺失突变体的提取物的 HPLC图谱。图下部是从vid基因缺失突变体分离的化合物的结构。用蒸发光散射检测器 (ELSD)检测色谱图。

图3显示了本发明所发现的去甲氧绿胶霉素的生物合成过程中由VidF，VidP和VidH介导的孕烷侧链切割机制。

图4显示了对纯化的重组VidF进行的SDS-PAGE分析结果，其中利用镍亲和层析纯化N-末端使用6x His标记的VidF，重组VidF的分子量约为61kDa。

图5显示了酶法测定的HPLC分析。(a)同时添加化合物7、VidF和NADPH；(b)同时添加化合物7、灭活的VidF和NADPH；(c)仅添加化合物7和VidF；(d)化合物5(标准品)； (e)化合物7和5的结构。

图6显示了喂食实验后进行HPLC分析的结果。其中，(a)携带vidP的米曲霉同时添加化合物5；(b)携带空载体的米曲霉同时添加化合物5；(c)携带vidP的米曲霉；(d)携带vidH 的米曲霉同时添加化合物4；(e)携带空载体的米曲霉同时添加化合物4；(f)携带vidH的米曲霉；(g)化合物5标准品；(h)化合物4标准品；(i)化合物9标准品；(j)化合物5， 4和9的结构。

图7显示了VidF，VidP和VidH介导对孕酮的侧链切割。(a)携带vidF+H+P的米曲霉(JA4) 同时添加化合物10；(b)携带空载体的米曲霉同时添加化合物10；(c)携带vidF+H+P的米曲霉；(d)化合物13标准品；(e)化合物12标准品；(f)化合物10标准品；(g)化合物10-14的结构。

具体实施方式

还可进一步通过实施例来理解本发明，然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

术语“甾体化合物”，也被称为甾体，是一种存在于自然界中的一类天然化学成分，包括植物甾醇、胆汁酸、C21甾类、昆虫变态激素、强心苷、甾体皂苷、甾体生物碱、蟾毒配基等。甾体化合物虽然种类众多，但是结构上具有相同的结构，均具有环戊烷多氢菲的基本骨架结构，同时在环戊烷多氢菲母核上通常带有两个角甲基(C-10、C-13)和一个含有不同的碳原子数的侧链或含氧基团如羟基、羰基等(C-17)(见下式)。

术语“绿胶霉素类化合物”，为由真菌产生的一系列C环芳香化且C-4和C-6位骈合一个呋喃环的甾体化合物，是一类活性广泛且结构特殊的真菌次级代谢产物。这类化合物的结构特点在于甾体骨架(A、B、C和D环)的C-4和C-6位间骈合一个环张力较大的呋喃环(E环)(如下式所示)，因此这类化合物又称呋喃甾体类化合物(结构见下式)。

目前发现的天然来源的绿胶霉素类化合物均是真菌的次级代谢产物，曾在黏帚菌属(Gliocladium)、青霉属(Penicillium)、多节孢属(Nodulisporium)、木霉属(Trichoderma)、膜盘菌属(Hymenoscyphus)、漆斑菌属(Myrothecium)和蓝状菌属(Talaromyces)中被分离得到。按照其结构特点，可分为绿胶霉素(viridin)及其衍生物、渥曼青霉素(wortmannin) 及其衍生物以及viridin-related B-norsteroid类化合物。其中viridin及其衍生物的结构特点在于结构中的甾体骨架不发生开裂和降解；wortmannin及其衍生物的结构特点在于结构中甾体骨架的在C-2/C-3间发生开裂；viridin-relatedB-norsteroid类化合物的结构特点在于结构中的甾体骨架的B环发生重排而形成一个五元环。

绿胶霉素化合物的生物合成前体是羊毛甾醇。而羊毛甾醇在C17位连接有包含七个碳的侧链，因此在绿胶霉素化合物的合成过程中，需要伴随着对侧链剪切或者修饰。其中已知在 C20-C22位会发生一次侧链的断裂和修饰，因此推测形成具有结构的侧链的甾体化合物中间产物，由于作为终产物的绿胶霉素类化合物在第17碳直接仅直接与双键氧(＝O)连接，而不与碳原子连接，因此这就需要在最终形成绿胶霉素类化合物之前，在第17位碳发生断裂和/或修饰。

在本发明所提供的VidF蛋白是一种单加氧酶(monooxygenase)，能够在C17和C20之间催化发生拜耳－维立格氧化重排反应(Baeyer-Villiger反应)，其中拜耳－维立格氧化重排反应(Baeyer-Villiger氧化重排反应)是在羰基和一个邻近烃基之间引入一个氧原子，得到相应的酯的化学反应，经过上述反应，使得C17位侧链为的甾体化合物在C17位转变为结构。

在一个实施方案中，VidF蛋白所作用的底物是C17位侧链为结构的甾体化合物。

在一个具体实施方案中，所述甾体化合物是指在绿胶霉素类化合物合成过程中的天然中间产物，例如3-Dihydrovirone，并获得化合物5(Nodulisporiviridin N)

虽然VidF蛋白的天然功能是在合成绿胶霉素类化合物过程中，催化甾类化合物C17-C20 之间的修饰，但是VidF也同样可被用于对其他结构相近底物的修饰。例如，在一个实施方案中，VidF蛋白的作用底物是孕烷或孕酮。

在一个具体实施方式中，VidF的多肽序列如SEQ ID NO：1所示，其编码核酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明提供的VidP蛋白是一种脂酶，其能够使酯键水解，在本发明的一个实施方案中， VidP能够对经过VidF蛋白修饰后的C17侧链中的酯键进行切割，从而在C17位留下一个羟基结构。

在一个具体实施方方案中，VidP以化合物5(即VidF的催化产物)为底物，产生在C17 位带有羟基的化合物4(Nodulisporiviridin M)。

在一个具体实施方案中，VidP的多肽序列如SEQ ID NO：2所示，其编码核酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明提供的VidH是一种脱氢酶，在本发明的一个实施方案中，VidH能够对经过VidP 蛋白修饰后的C17位连接的羟基进行脱氢反应，从而在C17位形成“＝O”结构。

在一个具体实施方案中，VipH以化合物4为底物，催化C17位的羟基转为＝O，从而获得化合物9(Nodulisporiviridin K)。

在一个具体实施方案中，VidH的多肽序列如SEQ ID NO：3所示，其编码核酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在本发明的一个实施方案中，将VidF、VidP和VidH形成一个蛋白或基因的组合，同时用于对甾体化合物C17位的修饰，在另一个实施方案中，可以选用两个蛋白或基因的组合，例如VidF+VidP、VidP+VidH；在另一个实施方案中，可以仅适用一个蛋白或基因，例如仅适用VidF、VidP或VidH。在不使用三种蛋白或基因的组合的情况下，需要针对组合的情况，相应的调整甾体化合物底物的种类，而这是本领域技术人员在看到本公开后，容易自行调整确定的。

实施例

材料与方法

1、对多节孢属真菌Nodulisporium Sp.(65-12-7-1)进行全基因组测序

多节孢属真菌Nodulisporium Sp.(65-12-7-1)(Zheng,Q.-C.etal.Nodulisporisteriods A and B,the first 3,4-seco-4-methyl-progesteroids fromNodulisporium sp.Steroids 78,896-901,2013； Zhao,Q.et al.NodulisporiviridinsA-H,bioactive viridins from Nodulisporium sp.J.Nat.Prod.78, 1221-1230,2015)保存在土豆琼脂PDA培养基上，接种到麦芽糖液体培养基中(3％maltose, 0.25％maltextract,0.15％yeast extract,0.2％KH2PO4,0.1％MgSO4,0.4％CaCO3)，于28℃、转速为180转/min的条件下发酵3天。过滤收集菌丝，液氮研磨，苯酚氯仿法提取DNA，使用Illumina HiSeq 2500system进行全基因组测序。测序数据利用软件SOAPdenovo version2.04 (http://soap.genomics.org.cn/soapdenovo.html)进行分析共得到381个重叠群(Contig)，长度约 36.9Mb。使用软件AUGUSTUS(http://bioinf.uni-greifswald.de/webaugustus/)进行基因预测。

2、构建基因敲除菌株

利用CRISPR/Cas9敲除系统对选定的三个基因(vidF,vidP,vidH)逐个进行敲除。具体方法如下：

(1)体外转录纯化gRNA

以质粒pUCm-gRNAscaffold-eGFP(Zheng,Y.-M.et al.Development of aversatile and conventional technique for gene disruption in filamentous fungibased on CRISPR-Cas9technology. Sci.Rep.7,9250,2017)为模板，通过引物gRNA-vidF-F(SEQ ID NO：7)、gRNA-vidP-F(SEQ ID NO：8)、gRNA-vidH-F(SEQ ID NO：9)和eGFP-R(SEQID NO：10)扩增含有T7启动子、20bp靶位点序列、gRNA骨架序列、tttt终止信号和eGFP的片段，加A后连接于T 载体，挑选阳性转化子时使用引物M13-F/eGFP-R，送阳性转化子测序验证，成功构建质粒 pUCm-gRNA-vidF，pUCm-gRNA-vidP和pUCm-gRNA-vidH。

随后，以上述质粒为模板，利用引物pUCm-F(SEQ ID NO：11)和gRNA-R(SEQ ID NO：12)进行PCR扩增并纯化，使用高保真的KOD Plus聚合酶扩增模板，经浓度测定和电泳检测合格后，作为体外转录gRNA的DNA模板。然后进行体外转录。转录操作按照Promega 公司T7RiboMAXTMExpress Large Scale RNA Production System说明书的要求，配制反应体系，在37℃下孵育30min，期间不要冻结转录反应。转录反应完成后，加入1μL RQ1 RNase-Free DNase去除DNA模板和未掺入的rNTP，再在37℃下孵育15min。

然后使用Qiagen公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit进行RNA纯化，具体过程如下：操作过程中，使用“DNA and RNA away”将所需用到的器皿、移液枪、仪器等进行无酶处理，使用DEPC处理过的枪头；在样品中加入80μL Rnase-free water，使体积为100μL；加入350 μL Buffer RLT混匀；加入250μL无水乙醇混匀；立即将溶液转移入吸附柱中，8000g离心 20s，倒掉收集管中溶液；将吸附柱放入新的2mL收集管中，加入500μL Buffer RPE，8000g，离心20s；加入500μL 80％乙醇，8000g，离心2min；将吸附柱放入一个新的收集管中开盖，15000g，离心5min；将吸附柱放入新的1.5mL收集管中，在吸附柱中央加入20uL Rnase-free water，15000g，离心1min；紫外分光光度计测定浓度，-80℃保存。

(2)获得线性的neo抗性表达框

以质粒pBSKII-PtrPC-neo-TtrPC(Zheng,Y.-M.et al.Development of aversatile and conventional technique for gene disruption in filamentous fungibased on CRISPR-Cas9technology. Sci.Rep.7,9250，2017)为模板，使用引物PtrpC-XbaI-F(SEQ ID NO：13)/TtrpC-HindШ-R (SEQ ID NO：14)，使用高保真的KOD Plus聚合酶进行扩增，获得抗性片段。

(3)制备原生质体，进行转染实验

1)将表达Cas9蛋白的多节孢属真菌Nodulisporium Sp.(65-12-7-1)的JN1001菌株(Zheng,Y. -M.et al.Development of a versatile and conventional techniquefor gene disruption in filamentous fungi based on CRISPR-Cas9technology.Sci.Rep.7,9250,2017)的孢子保存液 100μL加入到含有10mL DPY培养基的50mL试管中，30℃，150rpm，振荡培养1-2d。

2)将10ml的前培养液加入到装有100mL DPY培养基的100mL锥形瓶中，充分混合均匀， 30℃，120-150rpm，震荡培养24h。

3)制备10mL的TF solution 1，用0.22μm滤膜过滤50mL离心管。

4)取30mL左右的菌液，利用灭菌好的塞有棉花的注射筒过滤器进行过滤，将菌体压干，用灭菌后的竹签将菌体取出，放入装有TF solution 1的离心管中。在30℃的恒温箱中振荡破壁3h。

5)利用塞有棉花的注射筒过滤器，将破壁的菌液过滤到50mL的试管中。如果出现堵塞现象，可以用竹签挑一下棉花表面，不要强用力，以免破坏原生质体。

6)加入等量的TF solution 2(约10mL)，上下颠倒试管，轻轻混匀。常温，1500rpm离心 10min。倒去上清，加入5mL的TF solution 2，1500rpm离心10min。

7)用血球计数板在显微镜下计数原生质体的数目，利用TF solution 2调整原生质体浓度为 1-5×107/mL。

8)用1mL的枪头取200μL的原生质体溶液至15mL的离心管中，加入40-60μg gRNA与2-3μg neo抗性片段，轻轻地混匀。在冰上静置30min。向混悬液中分三次分别加入250μL，250μL，850μL的TF solution 3，每次加入后，都用1mL枪头轻轻吹吸。室温下静置20 min。

9)加入5mL的TF solution 2，上下颠倒试管，轻轻混匀。1500rpm离心10min，除去上清，加入200μL的TF solution 2，用1mL的枪轻轻地混悬，下层培养基中。然后迅速加入5mL 50℃保温的上层培养基，快速混匀。

10)平板表面充分干燥后，用parafilm缠好，盖朝下进行培养3-7天。将获得转化株在不含 Sorbitol的筛选培养基上传代1-3次，获得稳定敲除菌株ΔvidF-JN1001，ΔvidP-JN1001和 ΔvidH-JN1001。

3、表达纯化VidF蛋白

1)首先构建重组质粒，以Nodulisporium sp.(No.65-12-7-1)cDNA为模板，使用引物 VidF-NdeI-F(SEQ ID NO：15)/VidF-NotI-R(SEQ ID NO：16)扩增vidF基因，然后将片段连接到NdeI和NotI酶切的质粒pET-28a(+)(Novagen)中，构建质粒pET-28a (+)-vidF。

2)将重组质粒转化到宿主E.coli BL21-Codon Plus(DE3)(TaKaRa)中进行表达。

3)转化子接种至5mL含有50μg/mL Kanamycin的LB液体培养基中37℃，200rpm培养过夜。

4)按1％接种量接入到含有50μg/mL Kanamycin的LB培养基中(500mL三角瓶装液量150 mL)，37℃，200rpm培养3h左右至OD600值0.5-0.7，加入IPTG至终浓度为0.1mM， 18℃诱导表达16小时。

5)菌液4℃，5000g离心10min，弃掉上清液，然后用一定量的50mM Tris-HCl(8.0)清洗菌体一次，再次离心后收集菌体，放置于-80℃冰箱中冻存。

6)取出冻存的菌体按40mL/1L菌液的比例添加裂解液(50mM Tris-HCl,200mMNaCl,5 mM imidazole,5％glycerol,pH 8.0)。充分混悬菌体，然后放置在冰上静置30min。

7)将菌液装在50mL离心管中，然后放置在冰水中。将超声破碎仪功率调至20％，工作5s，休息5s，持续时间5分钟。

8)超声一次后，取出离心管上下颠倒几次后，继续超声破碎5min。

9)将破碎液经4℃，10000g离心10min，上层液经0.4μm过滤后用于进一步纯化。

10)取4mL Ni SepharoseTM 6Fast Flow装填于Poly-Prep ChromatographyColumn中(柱体积为3mL)。待上清液流至凝胶表面时，添加6mL超纯水冲洗。重复3次。用6mL缓冲液平衡凝胶柱，重复3次。

11)将过滤后的含有目标蛋白的上清液体添加至凝胶柱中，并收集流出液。

12)待液体流至表面时，用15-50倍柱体积的Wash Solution(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,20 mM imidazole,5％glycerol,pH 8.0)洗脱杂蛋白。(收集后期Washsolution洗脱液，用于电泳检测是否有目标蛋白洗脱出)

13)待液体流至表面时，用5mL的Elution Solution(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,300mM imidazole,5％glycerol,pH 8.0)洗脱目标蛋白，并收集流出液。重复4次。

14)通过SDS-PAGE电泳检测目标蛋白主要富集于哪一份洗脱液中。

15)将含有目标蛋白的洗脱液转移至Amicon Ultra-4浓缩过滤管中，经4℃，4000g离心20 min，浓缩至1-2mL，然后向过滤管中继续添加透析液进行溶液交换，重复数次，直至稀释比率约为1000。

16)将透析后的蛋白转移至离心管中，4℃，8000g离心3min，取上层蛋白液分装至离心管中，先在液氮中速冻，然后放置在-80℃冰箱中保存。

17)浓度测定采用Bradford方法，牛血清蛋白为标准品。

4、体外酶活性实验

将纯化的VidF和底物3-dihydrovirone(7)在100μL溶液中反应，反应体系如下：50mM Tris-HCl(pH 8.0),125μM NADPH,0.25mM 7,1mM FAD,2μM VidF，25℃，150rpm震荡反应24h。反应液用乙酸乙酯终止，萃取两遍，提取物进行HPLC分析。

5、构建米曲霉A.oryzae NSAR1异源表达菌株

构建单基因表达菌株，分别从Nodulisporium sp.(No.65-12-7-1)基因组中扩增出目标基因(VidF,VidP,VidH)，通过In fusion连接方法连接到目标质粒pTAex3(Fujii,T.,Yamaoka,H., Gomi,K.,Kitamoto,K.&Kumaga,C.Cloning and nucleotide sequenceof the ribonuclease T1 gene(rntA)from Aspergillus oryzae and its expression inSaccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae.Biosci.Biotechnol.Biochem.59,1869-1874,1995)上，形成重组质粒 pTAex3-vidF，pTAex3-vidP，pTAex3-vidH。

构建含有两基因(vidP,vidH)的表达质粒，分别从含有淀粉酶启动子和终止子的质粒 pTAex3-vidP，pTAex3-vidH中扩增出的DNA片段，然后用In fusion连接方法连接到pAdeA质粒(Jin,F.J.,Maruyama,J.,Juvvadi,P.R.,Arioka,M.&Kitamoto,K.Developmentof a novel quadruple auxotrophic host transformation system by argB genedisruption using adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillusoryzae.FEMS Microbiol.Lett.239,79-85，2004)中，构建两基因表达质粒pAdeA-vidP-vidH。

将单基因表达质粒pTAex3-vidP，pTAex3-vidH分别转染到A.oryzae NSAR1(Jin,F.J., Maruyama,J.,Juvvadi,P.R.,Arioka,M.&Kitamoto,K.Development of a novelquadruple auxotrophic host transformation system by argB gene disruptionusing adeA gene and exploiting adenine auxotrophy in Aspergillus oryzae.FEMSMicrobiol.Lett.239,79-85，2004)中，构建只含VidP的米曲霉表达菌株JA1，和只含VidH的米曲霉表达菌株JA2将质粒pTAex3-vidF， pAdeA-vidP-vidH共同转染到A.oryzae NSAR1中，构建三基因(VidF,VidP,VidH)共表达菌株JA3。

6、米曲霉喂养实验

将A.oryzae NSAR1转化菌株(JA1，JA2，或者JA3)，接种到10mL DPY培养基中培养2天作为种子液，然后将种子液接种到50mL CD培养基中进行诱导表达，培养1天后，向培养基中加入1mg底物(化合物5,4和9)(溶解在20μL DMSO中)，继续培养4天后终止发酵。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取2遍，提取物用HPLC进行分析。

7、化合物的分离纯化

化合物1和2的分离纯化：发酵2L的野生型菌株JN1001培养液用乙酸乙酯萃取2次。提取物经ODS中低压柱色谱洗脱(甲醇-水25:75，100:0，v/v)，含有目标化合物的子馏分再经HPLC制备(25％乙腈-水，3mL/min)得到化合物1(18.2mg)和2(5.8mg)。

化合物3和4的分离纯化：发酵1L的敲除菌株ΔvidH-JN1001培养液用乙酸乙酯萃取2 次。提取物经ODS中低压柱色谱洗脱(甲醇-水25:75，100:0，v/v)，含有目标化合物的子馏分再经HPLC制备(25％乙腈-水，3mL/min)得到化合物3(5.5mg)和4(3.5mg)。

化合物5的分离纯化：发酵1L的敲除菌株ΔvidP-JN1001培养液用乙酸乙酯萃取2次。提取物经ODS中低压柱色谱洗脱(甲醇-水35:65，100:0，v/v)，含有目标化合物的子馏分再经HPLC制备(45％甲醇-水，3mL/min)得到化合物5(9.5mg)。

化合物6,7和8的分离纯化：发酵3L的敲除菌株ΔvidF-JN1001培养液用乙酸乙酯萃取 2次。提取物经ODS中低压柱色谱洗脱(甲醇-水35:65，100:0，v/v)，含有目标化合物6和 7的子馏分经HPLC制备(30％乙腈-水，3mL/min)得到化合物6(6.5mg)和7(9.5mg)。含有目标化合物8的子馏分经HPLC制备(60％甲醇-水，3mL/min)得到化合物8(5.2mg)。

化合物11和14的分离纯化：发酵1L的米曲霉转化菌株JA3，喂养底物孕酮progesterone (150mg溶解在2mL DMSO)，培养液用乙酸乙酯萃取2次。提取物经硅胶柱洗脱(氯仿- 甲醇100:0，80:20，v/v)得到3个馏分。馏分2(245.7mg)经中低压洗脱(甲醇-水5:5，8.5:1.5，10:0，v/v)，含有目标化合物的子馏分再经HPLC制备(70％甲醇-水，3mL/min)得到化合物11(23.5mg)和14(14.5mg)

8、实施例涉及的部分化合物的结构、名称、编号以及核磁确认数据

化合物1核磁数据：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δH8.79(H,s),8.61(H,d,8.2),7.88(H, d,8.2),6.15(H,br d,5.8),4.38(H,dt,10.8,5.3),3.62(H,ddd,19.0,7.4,4.0),3.52(H,ddd,19.1, 7.4,3.9),3.08(H,dd,18.1,10.8),2.74(H,dd,18.1,5.1),2.64(2H,td,7.1,4.2),1.57(3H,s)；13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δC205.7,190.1,172.7,157.1,156.4,149.5,145.7,144.5,136.4,129.6, 128.5,126.3,123.0,70.9,46.6,41.6,35.8,28.2,25.3.

化合物213C NMR(100MHz,DMSO-d6)及1H NMR(400MHz,DMSO-d6)数据和归属。