专利摘要

本发明公开了属于生物技术领域的一种具有抗缺氧作用的化合物。本发明的首次发现了从绞股蓝中分离纯化的达玛烷型三萜皂苷具有新的活性，即抗缺氧活性。本发明提供了从绞股蓝中分离得到的五种达玛烷型三萜皂苷通过细胞实验、小鼠实验表明具有明显的抗缺氧活性。本发明为制备新的抗缺氧药物提供了备选化合物，对绞股蓝等中药材的开发利用具有重要的意义。

权利要求

1.达玛烷型三萜皂苷化合物在制备抗缺氧药物中的应用，其特征在于，所述达玛烷型三萜皂苷化合物的结构式如下：

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种达玛烷型三萜皂苷在抗缺氧中的应用。

背景技术

缺氧是指细胞、组织或生物机体所处环境中氧气的严重减少。病理条件下的缺氧可导致组织损伤，参与到多种疾病的进展及恶化，例如心梗和脑梗。环境缺氧(高海拔地区或深水潜水)可降低动脉血氧饱和度并诱导全身机体组织缺氧，诱发缺氧性疾病。因此，在物理上(如轻度缺氧预处理)或化学(药物施用)发现有效干预对于预防缺氧相关疾病至关重要。

模型动物和临床干预试验已证明天然化合物可能在预防缺氧损伤中起保护作用。槲皮素和红景天甙是这一策略的典型代表。据报道，槲皮素通过抗氧化和抗凋亡机制保护海马神经元免受低压缺氧损伤。红景天甙对身体或细胞有抵抗缺氧的保护作用。它改善了缺氧小鼠诱导的高原肺水肿，减轻了缺血性脑损伤。因此，从天然产物中筛选和鉴定具有抗缺氧活性的新的化合物是研发抗缺氧药物可行有效的方法。

从绞股蓝中提取得到的绞股蓝总皂苷具有多种生物活性，包括拮抗癌症，减轻炎症，预防心血管等，并且没有显著的药物不良反应。绞股蓝总皂苷在脑疾病的治疗中表现出积极的作用。例如绞股蓝总皂苷可以改善海马中脂多糖刺激引起的认知功能障碍和慢性炎症。绞股蓝总皂苷不仅可以保护大鼠皮质细胞的原代培养物免受体外氧化神经毒性的影响，还可以减少梗塞体积，改善大脑中动脉闭塞后的运动功能。由此可以看出，绞股蓝总皂苷为防治缺氧性疾病提供了更多药物选择。绞股蓝总皂苷是多类型化合物的复合物，目前，关于其哪些生物活性成分起着抗缺氧活性尚不清楚。筛选和鉴定具有抗缺氧活性的化合物单体对于药物研发和疾病的对症治疗都具有重要临床价值。

发明内容

本发明提出了五种达玛烷型三萜皂苷具有显著的抗缺氧作用，可用于防治缺氧性疾病，从而增加了其应用领域。

本发明的达玛烷型三萜皂苷在制备抗缺氧药物中的应用，是五种达玛烷型三萜皂苷在制备防治缺氧性损伤药物中的应用。所述化合物结构式如下：

所述达玛烷型三萜皂苷化合物是从绞股蓝中分离得到的，具有提高缺氧条件下的细胞活力并减轻高原缺氧导致的脑组织损伤。

所述达玛烷型三萜皂苷化合物在制备抗缺氧药物中的应用，大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞经氧气为0.3％的物理缺氧后，细胞活力显著降低，但经达玛烷型三萜皂苷预处理后，细胞活力被逆转上升。

以结构式5为代表的达玛烷型三萜皂苷预处理C57BL/6小鼠2周后，然后进行模拟的高原缺氧(8000米海拔，24小时)，脑组织损伤减轻。

有益效果：本发明提出的五种达玛烷型三萜皂苷为首次发现的新化合物，具有提高缺氧条件下的细胞活力，减轻高原缺氧导致的脑组织损伤，在抗缺氧中的应用，为制备新的抗缺氧药物提供了备选化合物，对绞股蓝等中药材的开发利用具有重要的意义。

附图说明

图1为五种达玛烷型三萜皂苷化合物的结构式图。

图2为五种达玛烷型三萜皂苷化合物对缺氧导致的PC12细胞损伤的保护作用图。

图3为结构式5的达玛烷型三萜皂苷化合物对模拟高原缺氧导致的脑组织损伤保护作用图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

五种达玛烷型三萜皂苷化合物的结构式如图1所述。

实施例1

体外实验证实化合物具有抗缺氧活性

1.细胞培养

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞由本研究室冻存。细胞培养于含10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI-1640培养液(Gibco公司)中，在5％CO2、37℃饱和湿度条件下培养，并取对数生长期细胞进行实验。

2.细胞活力检测

采用细胞增殖/毒性测定(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂盒(日本Dojindo公司)检测细胞活力水平。对数生长期PC12细胞接种于96孔板中，每孔4000个细胞。细胞分为对照组和药物处理组，每一种单体化合物的浓度分别是3,30μM。缺氧组细胞放置于O2浓度为0.1％的缺氧箱中。待处理组到达时间点后，向每孔加入10μl CCK-8溶液，将培养板放在培养箱内孵育2h，然后用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD450)。设定对照组细胞的活力为100％，计算各处理组细胞活力的相对百分数。

3.实验结果

我们选择了氧浓度为0.3％的物理缺氧模型，CCK8检测结果显示，如图2所述，PC12细胞给予缺氧处理24h后，细胞活力显著降低，仅为对照组的49.52％。但是经不同结构的达玛烷型三萜皂苷化合物预处理6h后再经缺氧损伤处理，PC12细胞活力均有不同程度的上升，统计学比较具有显著性差异(*p<0.05,**p<0.01)。以上结果说明达玛烷型三萜皂苷化合物对在细胞模型上对缺氧损伤具有保护作用。

实施例2

体内实验证实化合物具有抗缺氧活性

1.小鼠及模拟高原缺氧暴露

实验动物为合格实验动物用C57BL/6小鼠，雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于恒温(23±2℃)、恒湿动物室，每天12/12h昼夜循环，可自由进食进水。模拟高原环境的低压缺氧动物实验舱购自贵州风雷航空军械有限责任公司，型号：DYC-DWI。该舱连接有两个抽气泵，可以将舱内气体不断抽出舱外，从而模拟某一海拔高度的低压缺氧环境；同时接有电子显示屏和氧传感探头(实时显示舱内所处的海拔高度及氧浓度)。20只小鼠随机分为四组：常氧组，药物处理组(5#达玛烷型三萜皂苷化合物50mg/kg/day，灌胃两周)，高原缺氧组，药物处理联合高原缺氧组，每组各5只。高原缺氧处理时，将小鼠置于低压缺氧舱内适应10min。然后设置低压缺氧舱中的模拟海拔高度以50m/s的速度上升至海拔8000米，然后开始计时，处理时间为24h。各组处理完毕后，小鼠戊巴比妥钠麻醉处死，然后分离全脑并放入预先配好的固定液(10％福尔马林)中进行固定。

2.Nissl(尼氏)染色

(1)脱蜡复水：将石蜡切片连同切片架放入60℃水浴锅中加热至蜡熔化，之后，用二甲苯溶液对石蜡切片脱蜡，再放入高浓度到低浓度梯度的酒精溶液中脱水，最后用蒸馏水冲洗。

(2)染色：1％甲苯胺蓝50-60℃温箱染色40分钟。

(3)蒸馏水洗3次，每次3min。

(4)95％乙醇分化至尼氏小体呈蓝色。

(5)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

(6)显微镜下观察并拍照。

3.实验结果

尼氏染色结果如图3所述，正常组小鼠海马组织结果中各分区(CA1，CA3，DG)的细胞结构完整，染色均一，细胞排列整齐。药物处理组中的结构形态与对照组相似。但是，在单纯的高原缺氧处理组中，DG区的细胞排列松弛，并且细胞数量显著减少。然后再经药物预处理两周再经高原缺氧的小鼠中，我们观察到各分区的细胞又回归正常，缺氧损伤受到抑制。从以上结果可以看出，以5#达玛烷型三萜皂苷化合物为代表的达玛烷型三萜皂苷化合物在体内模型中对高原缺氧损伤具有预防作用。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

达玛烷型三萜皂苷在抗缺氧中的应用专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。