专利摘要

本发明公开了一种生物4D打印导电溶液墨水及其制备方法，以酯化后的聚吡咯、聚乳酸、胶原蛋白、和丝蛋白为原料，神经生长因子(NGF)、脑源性营养因子(BDNF)等为生物活性因子，先将生物活性因子均匀分散到灭菌后的一定浓度的再生丝蛋白溶液中，再用静电喷射法将该溶胶喷射到以一定速度搅拌的甘油中，经离心分离后，沉淀物用超净水清洗后再离心分离，重复3次后，得到再生蚕丝蛋白包覆NGF和BDNF的微胶囊，再将微胶囊分散到灭菌后的酯化聚吡咯/再生丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液中，形成4D生物打印导电溶液墨水。本发明的制备方法，工艺、设备简单，稳定可靠，操作方便，制得的导电溶液墨水，可用于制备神经组织和心肌组织工程支架及其药物的筛选材料。该技术简单易行，适用范围广。

权利要求

1.一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 步骤一：将所需的原材料和耗材经灭菌消毒且在无菌操作室内进行操作，无菌操作室的温度控制在25 度以下；以下各操作步骤也均在无菌室内进行；

步骤二：将生物活性因子均匀分散到灭菌后的一定浓度和温度的再生丝蛋 白溶液中；

步骤三：把步骤二所得到的混合物，用静电喷射法以一定的电压和一定的 流速，喷射到以一定速度搅拌的甘油中；

步骤四：把步骤三所得到的混合物进行离心分离，沉淀物用超净水清洗后 再离心分离，重复 3 次，得到再生蚕丝蛋白包覆生物活性因子的微胶囊；

步骤五：把步骤四所得到的微胶囊分散到一定浓度的灭菌后的按一定比例 配制的酯化聚吡咯、再生丝蛋白、聚乳酸和胶原蛋白混合溶液中，形成 4D 生物 打印导电溶液墨水。

2.根据权利要求1所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其 特征是所述的步骤二中的生物活性因子指的是营养因子。

3.根据权利要求 2 所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其 特征在于所述的营养因子为神经生长因子。

4.根据权利要求1所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特 征是所述的步骤二中一定浓度和温度的再生丝蛋白溶液，是指浓度≤5 wt%，温 度 4 oC~37oC 的再生丝蛋白溶液。

5.根据权利要求1 所述的一种 4D生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特征是所述的步骤三中一定的电压，电压在 10 kV ~ 30 kV。

6.根据权利要求 1 所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特征是所述的步骤三中一定的流速，流速在 0.2mL/h ~ 1.2mL/h。

7.根据权利要求1所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特征是所述的步骤三中一定速度搅拌的甘油，搅拌速度在 400 rpm~1200rpm。

8.根据权利要求1所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨水的制备方法， 其特征是所述步骤五中的一定浓度的灭菌后的酯化聚吡咯、再生丝蛋白、聚乳 酸和胶原蛋白混合溶液，是指混合溶液的浓度在 5 wt% ~ 45 wt%。

9.根据权利要求8所述的一种 4D 生物打印导电溶液墨的其制备方法， 其特征是所述步骤五中一定比例是指酯化聚吡咯的含量为 10 wt%~35 wt%。

10.根据权利要求8 所述的一种 4D生物打印导电溶液墨水的制备方法，其特征是所述步骤五中酯化聚吡咯、再生丝蛋白、聚乳酸和胶原蛋白混合溶液，其中酯化聚吡咯含量为10%-35%，再生丝蛋白含量为 50%-60%，聚乳酸 含量为 10%-20%，胶原蛋白的含量 5%-10%。

说明书

技术领域

本发明涉及生物材料及其制备方法，尤其是4D生物打印导电溶液墨水及其制备方法。

背景技术

利用生物材料的优势，通过材料的设计和优化，将多种有效修复方法结合起来，制备多功能仿神经支架，必将给神经系统损伤修复和治疗带来新的希望。支架材料的选择和制作方法是决定其优劣的关键。3D打印技术的出现，为构建符合脊髓组织工程要求的支架带来了新的曙光。3D打印通过CAD软件层层相叠进行打印，具有通过程序调控、造模精确，可控制材料比例，调节材料各种参数达到最优效果和能构建复杂组织结构的优点。4D打印在3D打印的基础上，直接将设计内置到物料当中，实现了复杂结构件的降维打印成型，成型后在宏观尺度上的自我重组装，简化了从设计理念到实物的造物过程，实现了产品设计、制造和装配的一体化融合。

生物墨水(bioinks)是3D生物打印技术的核心，决定了在由它制备而成的稳定的、具有生物相容性的支架材料上的细胞增殖和分化形成的组织结构和功能。然而，用于3D打印的传统“墨水”，主要用于非生物应用，往往由金属和热敏或光敏聚合物或塑料组成。细胞生长需要温和的环境及人体组织具有复杂的结构和一定的机械性能，使得找到合适的生物材料作为3D生物打印bioinks成为重大的挑战。一个理想的bioink至少应该具有像细胞外基质(ECM)一样的功能，支持细胞和组织生长，适当的机械强度(溶胶–凝胶转变，自立的三维结构和负载生长因子)，具有传质(代谢物，营养和生长因子)功能，通过新的ECM沉积支持细胞代谢和组织的形成，以避免坏死。然而，3D可打印和细胞相容bioinks的缺乏，以及调整bioinks材料性能的有限，大大地阻碍了生物打印技术的发展。对温度、pH值和电等敏感的智能生物墨水是4D打印的核心和基础。除了结构设计和打印技术外，生物墨水材料对于实现4D效果至关重要。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于提供一种4D生物打印导电墨水的制备方法，既能满足神经细胞生长的结构和生物功能，又具有良好的可打印能力，打印成型后的供体在外界环境刺激下(如：pH值、温度和湿度变化及电刺激下)，或随着时间的推移、细胞的生长而在形态上发生自我调节，促进神经细胞生长的智能生物打印墨水及其制备技术，该墨水可用4D打印技术打印成神经组织和心肌组织工程支架材料或用于药物筛选的材料。

所采用的技术方案如下：

一种4D生物打印导电溶液墨水及其制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤一：将所需的原材料和耗材经灭菌消毒且在无菌操作室内进行操作，无菌操作室的温度控制在25度以下；以下各操作步骤也均在无菌室内进行；

步骤二：将生物活性因子均匀分散到灭菌后的一定浓度和温度的再生丝蛋白溶液中；

步骤三：把步骤二所得到的混合物，用静电喷射法以一定的电压和一定的流速，喷射到以一定速度搅拌的甘油中；

步骤四：把步骤三所得到的混合物进行离心分离，沉淀物用超净水清洗后再离心分离，重复3次，得到再生蚕丝蛋白包覆生物活性因子的微胶囊；

步骤五：把步骤四所得到的微胶囊分散到一定浓度的灭菌后的按一定比例配制的酯化聚吡咯/再生丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液中，形成4D生物打印导电溶液墨水。

步骤二中的生物活性因子指的是神经生长因子和/或营养因子，如NGF、BDNF。

步骤二中一定浓度和温度的再生丝蛋白溶液，是指浓度≤5wt％，温度4℃～37℃的再生丝蛋白溶液。

步骤三中一定的电压，电压在10kV～30kV。

步骤三中一定的流速，流速在0.2mL/h～1.2mL/h。

步骤三中一定速度搅拌的甘油，搅拌速度在400rpm～1200rpm。

步骤五中一定浓度的灭菌后的按一定比例配制的酯化聚吡咯/再生蜘蛛丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液，是指浓度在5wt％～45wt％。一定比例是指酯化聚吡咯的含量在10wt％～35wt％。

步骤五中酯化聚吡咯/再生丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液，其中酯化聚吡咯含量为10％-35％，再生丝蛋白含量为50％-80％，聚乳酸含量为10％-20％：胶原蛋白的含量5％-10％。

本发明所述的一种生物4D打印导电溶液墨水及其制备方法，以酯化后的聚吡咯、聚乳酸、胶原蛋白、和丝蛋白为原料，神经生长因子(NGF)、脑源性营养因子(BDNF)等为生物活性因子，先将生物活性因子均匀分散到灭菌后的一定浓度的再生丝蛋白溶液中，再用静电喷射法将该溶胶喷射到以一定速度搅拌的甘油中，经离心分离后，沉淀物用超净水清洗后再离心分离，重复3次后，得到再生蚕丝蛋白包覆NGF和BDNF的微胶囊，再将微胶囊分散到灭菌后的酯化聚吡咯/再生蜘蛛丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液中，形成4D生物打印导电溶液墨水。这种墨水的浓度、粘度和打印成型等性能可以通过改变丝蛋白的分子量大小，各原料组分的原始重量比等进行调控。

本发明的制备方法，工艺、设备简单，稳定可靠，操作方便，制得的导电溶液墨水，可用于制备神经组织和心肌组织工程支架及其药物的筛选材料。该技术简单易行，适用范围广。

具体实施方式

以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅供说明具体结构，该结构的规模不受实施例的限制。

实施例1

一种生物4D打印导电溶液墨水及其制备方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一：把所有要用到的经过灭菌消毒后的原材料和耗材等都放到无菌操作室中，无菌操作室的温度控制在25度以下。以下各操作步骤均在无菌室内进行。

步骤二：将神经生长因子(NGF)和脑源性营养因子(BDNF)同时均匀分散到灭菌后的5wt％，10℃的再生丝蛋白溶液中；

步骤三：把步骤二所得到的混合物，用静电喷射法在15kV的电压，以0.6mL/h的流速将该混合物喷射到以700rpm搅拌的甘油中；

步骤四：把步骤三所得到的混合物离心分离后，沉淀物用超净水清洗后再离心分离，重复3次，得到再生蚕丝蛋白包覆生物活性因子的微胶囊；

步骤五：把步骤四所得到的微胶囊分散到20wt％的灭菌后酯化聚吡咯/再生丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液中，其中酯化聚吡咯含量为15％，再生丝蛋白：聚乳酸：胶原蛋白的含量分别为60％，20％，和5％，形成4D生物打印导电溶液墨水。

实施例2

一种生物4D打印导电溶液墨水及其制备方法，是通过以下步骤实现的：

步骤一：把所有要用到的经过灭菌消毒后的原材料和耗材等都放到无菌操作室中，无菌操作室的温度控制在25度以下。以下各操作步骤均在无菌室内进行。

步骤二：将神经生长因子(NGF)和脑源性营养因子(BDNF)同时均匀分散到灭菌后的2wt％，37℃的再生丝蛋白溶液中；

步骤三：把步骤二所得到的混合物，用静电喷射法在15kV的电压，以0.6mL/h的流速将该混合物喷射到以700rpm搅拌的甘油中；

步骤四：把步骤三所得到的混合物离心分离后，沉淀物用超净水清洗后再离心分离，重复3次，得到再生蚕丝蛋白包覆生物活性因子的微胶囊；

步骤五：把步骤四所得到的微胶囊分散到35wt％的灭菌后酯化聚吡咯/再生丝蛋白/聚乳酸/胶原蛋白混合溶液中，其中酯化聚吡咯含量为35％，再生丝蛋白：聚乳酸：胶原蛋白的含量分别为50％，10％，和5％，形成4D生物打印导电溶液墨水。

一种4D生物打印导电溶液墨水及其制备方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。