专利摘要

本发明提供了一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法，所述高纯度是指纯度在99％(w/w)以上，所述方法包括：将含有布雷菲德菌素A的发酵液，经固液分离除固体杂质，然后以非极性大孔吸附树脂为吸附剂进行吸附层析操作，待树脂吸附至饱和，水洗去除未吸附杂质，再用体积浓度30～60％的极性溶剂水溶液洗脱，洗脱液减压蒸馏回收溶剂、浓缩，获得布雷菲德菌素A粗品，粗品进一步进行溶析结晶或冷却结晶操作，获得所述高纯度布雷菲德菌素A。本发明的有益效果主要体现在：生产工艺简单易行、产物收率高、易于实现规模化生产，得到的布雷菲德菌素A晶体纯度高(＞99％)，晶型规则、晶体展开性好，满足生物试剂对品质的高要求。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法。

(二)背景技术

布雷菲德菌素A(Brefeldin A)是一种天然存在的大环内酯类抗生素，化学名[(1R，2E，6S，10E，11as，14aR)-1，6，7，8，9，11a，12，13，14，14a-Decahydro-1，13-dihydroxy-6-methyl-4H-cyclopent[f]oxacyclotridecin-4-one]，分子式为C₁₆H₂₄O₄，分子量约280，化学结构式如下：

1958年，首次报道从Penicillium decumbens发酵液中分离得到布雷菲德菌素A(Singleton等，1958)。早期研究发现，布雷菲德菌素A抑制蛋白质由内质网向高尔基体复合物转运过程，具有抗细菌、抗真菌和抗病毒性质。布雷菲德菌素A作为一种蛋白转运抑制剂，能够影响蛋白质转运、加工过程，已成为细胞生物学家研究哺乳动物细胞信号转导途径的重要分子工具，具有一定的市场需求。1963年，NCI发现，在小鼠肿瘤模型上布雷菲德菌素A表现出抗肿瘤活性，小鼠的LD₅₀大于200mg/kg。研究发现，布雷菲德菌素A通过不依赖于p53凋亡机制诱导人前列腺癌细胞凋亡，Akira等联合使用低剂量布雷菲德菌素A提高吉西他滨(Gemcitabine)对人胰腺癌细胞MIA PaCa-2细胞线的作用效果。此外，布雷菲德菌素A及其化学衍生物具有除草活性。

布雷菲德菌素A生产方法分为化学合成法和发酵法。化学法合成布雷菲德菌素A具有反应步骤冗长、收率低等缺陷；发酵法生产布雷菲德菌素A具有高效和环境友好的特点。文献报道产布雷菲德菌素A的菌种包括青霉属(Penicillium)、斜卧青霉(Penicillium decumbens)、蓝青霉(Penicillium cyaneum)、苜蓿假盘菌(Phyllosticta medicaginis)、壳二孢属(Ascochyta)、拟青霉(Paecilomyces sp.)、布雷正青霉(Eupenicillium brefeldianum)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、分支孢属(Cladosporium sp.)、链格孢菌属(Alternaria zinniae)、茎点霉属(Phoma)、踝节菌属(Talaromyces sp.)。

美国专利U.S.3896002公开了产布雷菲德菌素A的菌株苜蓿假盘菌(P.medicaginis)及布雷菲德菌素A制备过程。McCloud等(1995)在中试规模上，E.brefeldianum ATCC 58665合成布雷菲德菌素A发酵单位达到169mg/L。赵玉芬等进行了布雷菲德菌素A产生菌选育和布雷菲德菌素A结构改造工作，她们报道的布雷菲德菌素A小试发酵水平为151.6mg/L。除制备工艺外，改性是布雷菲德菌素A研究的另一个热点，美国专利U.S.6,362,218、U.S.5,824,674、U.S.5,696,154、U.S.5,112,607、U.S.4,608,078公开了布雷菲德菌素A的衍生化反应及衍生物的生物学活性。

目前关于布雷菲德菌素A分离纯化的文献报道较少。Kim和Kochevar等(1995年)利用反相层析技术从发酵液中分离布雷菲德菌素A，但该项工作未报道具体的纯化效果，而且，C18反相硅胶对布雷菲德菌素A的吸附能力较弱，且该填料售价高，导致整个分离工艺的效率低、经济性差。Gao等(2010年)建立高速逆流色谱(HSCCC)和电喷雾质谱(ESI-MS)联用的方法提取布雷菲德菌素A，该方法存在单批处理量小、成本高等缺陷，不能满足大规模的高纯度布雷菲德菌素A生产的要求。发明人在中国发明专利CN200810163775.5中报道了蒸发结晶工艺，蒸发结晶技术从发酵液中制备布雷菲德菌素A工艺单次结晶产物纯度低，呈淡黄色，必须依赖重结晶才能制备99.0％纯度的晶体。而且，蒸发结晶制备的布雷菲德菌素A晶体晶型不规则，仍含有一定的色素残留，晶体品质较差，不能满足生物试剂对品质的高要求。

(三)发明内容

本发明的目的是克服现有技术上的缺陷与不足，提供一种设备简单、分离过程环境友好、产物综合收率高、晶体纯度高(99％以上)、晶体规则且工艺易控制和放大的布雷菲德菌素A的提取方法。

本发明采用的技术方案是：

一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法，所述高纯度是指纯度在99.0％(w/w)以上，所述方法包括：

(1)将含有布雷菲德菌素A的发酵液，经固液分离(离心、过滤或者乙酸乙酯萃取)去除固体杂质，得到澄清的布雷菲德菌素A发酵液上清液；

(2)以非极性大孔吸附树脂为吸附剂，对步骤(1)所得布雷菲德菌素A上清液进行吸附层析操作，待树脂吸附至饱和，水洗去除未吸附杂质，再以体积浓度30～60％的乙醇水溶液为洗脱剂洗脱，洗脱液减压蒸馏回收溶剂、浓缩，获得布雷菲德菌素A粗品；所述非极性大孔吸附树脂为下列之一或其中两种以上的混合物：HZ830、HZ820、HZ818、HZ816、HZ841、HZ801；

(3)将步骤(2)布雷菲德菌素A粗品复溶于乙醇中，得到布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，再以溶析结晶(通过以一定速度滴加水等反溶剂的方法，使得布雷菲德菌素A在结晶体系中的溶解度降低并以晶体形式析出)或冷却结晶(通过降温的方式使得布雷菲德菌素A晶体析出)方式进行结晶操作，所得晶体在-4.0×10^-3～-4.0×10^-1MPa、4～40℃条件下真空干燥1～24小时，即得所述高纯度布雷菲德菌素A。

具体的，所述步骤(1)中的布雷菲德菌素A可由布雷正青霉变种ZJB082702发酵得到。菌株ZJB082702为发明人从植物内生真菌中分离、经诱变后筛选得到，经鉴定为Eupenicillium brefeldianum，该菌株在已申请的CN200810163775.5中进行了详细描述，并于2008年07月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC No：M 208113。该菌株发酵水平在国内外已报道的相关文献中居于前列，可达943.8mg/L发酵液。

优选的，所述步骤(1)为：将含有布雷菲德菌素A的发酵液，9000r min^-1离心10分钟，收集上清液，即为所述澄清的布雷菲德菌素A发酵液上清液。

优选的，所述步骤(2)为：步骤(1)所得布雷菲德菌素A发酵液上清液用非极性大孔吸附树脂吸附至饱和，先用2～4B.V.(2～4倍床层体积)的水淋洗除杂，再用3～8B.V.的体积浓度30～80％的乙醇或甲醇水溶液以0.05～0.20B.V/分钟的流速洗脱，洗脱液在-4.0×10^-2～-8.0×10^-2MPa、40～60℃条件下减压蒸馏回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。

优选的，所述步骤(3)为：步骤(2)所得布雷菲德菌素A粗品进一步于30～70℃下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，然后进行冷却结晶操作：晶种投入量0.5～10.0mg/ml，控制降温速度为0.05～5℃/min，搅拌速度10～400r/min，出晶温度4～45℃，养晶时间0.5～72小时；抽滤，所得晶体在-4.0×10^-3～-4.0×10^-1MPa、4～40℃条件下真空干燥1～24小时，获得高纯度布雷菲德菌素A晶体。

或者，所述步骤(3)为：步骤(2)所得布雷菲德菌素A粗品常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，进行溶析结晶操作：晶种投入量0.5～10.0mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至乙醇∶水体积比为1∶0.5～5，搅拌速度10～400r/min，所有反溶剂0.5～24小时滴完，养晶0.5～72小时；抽滤，所得晶体在-4.0×10^-3～-4.0×10^-1MPa、4～40℃条件下真空干燥1～24小时，得到高纯度布雷菲德菌素A晶体。

本发明中所采用的布雷菲德菌素A含量的测定方法为液相色谱法。测定条件为：液相色谱仪LC-10AT(日本岛津)，色谱柱为C18反相柱(250mm×4.6mm，5μm，依利特，大连)，流动相为甲醇∶水＝7∶3(v/v)，流速0.6mL/min，柱温箱温度50℃。

本发明采用的吸附层析-结晶组合技术制备高纯度布雷菲德菌素A晶体(＞99％)技术为国内外首创，特别是溶析结晶、冷却结晶制备布雷菲德菌素A晶体未见国内外文献报道。本发明建立的溶析结晶、冷却结晶不同于申请人的另一项中国发明专利CN200810163775.5采用的蒸发结晶工艺，必须经过三次以上重结晶操作产物纯度才能达到99.07％，过程丙酮消耗量大，而且产物晶型不规则，大小不一，晶体展开性差、倾向于堆积，晶体品质差，不能满足生物试剂对品质的高要求。

本发明的有益效果主要体现在：生产工艺仅需一步吸附层系和一步溶析结晶操作、分离简单易行、易于放大而实现规模化生产；分离操作仅使用一种环境友好的溶剂——乙醇，环境友好，彻底革除有机溶剂的残留；产物收率高，得到的布雷菲德菌素A晶体纯度高(＞99％，最高可达99.9％)，形状规则，满足生物试剂对品质的高要求。

(四)附图说明

图1为溶析结晶制得的布雷菲德菌素A晶体照片；

图2为冷却结晶制得的布雷菲德菌素A晶体照片；

图3为蒸发结晶制得的布雷菲德菌素A晶体照片。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：布雷菲德菌素A发酵液制备

将经斜面活化的菌种E.brefeldianum CCTCC M 208113接种到装有70ml种子培养基的250mL三角瓶中，种子培养基每1000mL按如下方法配制：麦芽糖30.0g，酵母浸出粉2.5g，麦芽浸出物1.5g，碳酸钙4.0g，硫酸镁2.0g，磷酸二氢钾2.0g；用水补足至1000mL，pH自然(121℃，灭菌20min)，28℃培养40～60h，得到种子液。

将上述种子液按接种量3.0％(v/v)接种到装有发酵培养基的1.0L具挡板三角瓶中，装液量140ml。发酵培养基每1000mL按如下方法配制：淀粉13.3g，葡萄糖26.7g，酵母膏9.7×10^-1g，玉米浆1.0g，黄豆饼粉4.6×10^-1g，麦芽浸出物2.5g，硫酸镁3.0g，磷酸二氢钾4.0g，碳酸钙6.0g，硝酸钠7.4×10^-1g，硫酸铜1.0×10^-2g，水补足至1000mL，pH自然(121℃，灭菌20min)。摇床转速180rpm，28℃发酵培养6d，获得E.brefeldianum CCTCC M 208113发酵液。

将上述所得含有布雷菲德菌素A的发酵液，9000r min^-1离心10分钟，收集澄清的发酵液上清液。

实施例2：吸附层析用吸附介质选型

准确称取0.5g(干重)大孔吸附树脂HZ830、HZ820、HZ818、HZ816、HZ841、HZ801、置于50ml具塞三角瓶中，分别加入50ml由实施例1制得的布雷菲德菌素A发酵液上清液，30℃，180r/min条件下吸附24h至平衡，HPLC分析吸附前后溶液中布雷菲德菌素A浓度，计算吸附量。其中HZ830和HZ818显示出较大的布雷菲德菌素A吸附能力，分别为60.3和62.4mg/g干树脂。

取上述已达到吸附饱和的HZ818、HZ830树脂各0.5g于50ml具塞三角瓶中，先用50ml蒸馏水冲洗以除去残留于介质表面但未被吸附的布雷菲德菌素A，抽滤，将水除尽，再加入50％乙醇水溶液20ml，30℃，180r/min条件下洗脱24h，HPLC检测洗脱液中布雷菲德菌素A的浓度，计算洗脱率。结果显示，HZ830树脂的解吸率远高于HZ818树脂，分别为83.9％和68.8％。

因此，大孔吸附树脂HZ830是所试吸附介质中最优选的吸附介质。

实施例3：吸附层析工艺条件优化

取实施例1得到的布雷菲德菌素A发酵液上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.1B.V/min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水淋洗去除杂质，再用5B.V的40％(v/v)乙醇水溶液，以0.10B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A的纯度为93.1％，回收率为87.6％(w/w)。

取实施例1得到的布雷菲德菌素A发酵液上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.1B.V./min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去除杂质，再用5B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.10B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A的纯度为92.8％，回收率为91.7％(w/w)。

取按实施例1方法得到的布雷菲德菌素A发酵液上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V./min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去除杂质，再用4B.V.的60％(v/v)乙醇水溶液，以0.10B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A的纯度为87.9％，回收率为93.4％(w/w)。

取按实施例1方法得到的布雷菲德菌素A发酵液上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V./min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去杂质，再用4B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.08B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A纯度为91.5％，回收率为92.2％(w/w)。

取按实施例1方法得到的布雷菲德菌素A发酵液上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V./min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去杂质，再用5B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.06B.V/min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A的纯度为90.7％，回收率为93.1％(w/w)。

实施例4：布雷菲德菌素A溶析结晶工艺参数优化

将实施例3得到的布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量甲醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和甲醇溶液，水作为反溶剂进行溶析结晶。晶种投入量5mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A甲醇溶液，直至V_甲醇∶V_水＝1∶1，搅拌速度50r/min，所有反溶剂1小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.3％(w/w)，结晶收率70.3％，晶体无色透明，呈规则针状。

将实施例3得到的布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，以水作为反溶剂进行溶析结晶。晶种投入量5mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶1，搅拌速度50r/min，所有反溶剂1小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.1％(w/w)，结晶收率73.0％，晶体无色透明，呈规则棱状。

将实施例3得到的布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，以水作为反溶剂进行溶析结晶。晶种投入量5mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶2，搅拌速度50r/min，所有反溶剂2小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.9％(w/w)，结晶收率92.7％，晶体无色透明，呈规则棱状。

将实施例3得到的布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，以水作为反溶剂进行溶析结晶。晶种投入量5mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶2，搅拌速度50r/min，所有反溶剂3小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.9％(w/w)，结晶收率93.1％，晶体无色透明，呈规则棱状。

将实施例3得到的布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，以水作为反溶剂进行溶析结晶。晶种投入量5mg/ml，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶2，搅拌速度80r/min，所有反溶剂2小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.2％(w/w)，结晶收率93.4％，晶体无色透明，呈规则棱状。

实施例5：布雷菲德菌素A冷却结晶工艺参数优化

将按实施例3方法得到的布雷菲德菌素A粗品于60℃下用适量甲醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和甲醇溶液，通过降温的方式进行冷却结晶。晶种投入量5mg/ml，控制降温速度为0.2℃/min，搅拌速度80r/min，出晶温度30℃，养晶时间2.5小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.7％(w/w)，收率58.4％，晶体无色透明，短棒状。

将按实施例3方法得到的布雷菲德菌素A粗品于50℃下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，通过降温的方式进行冷却结晶。晶种投入量5mg/ml，控制降温速度为0.2℃/min，搅拌速度80r/min，出晶温度35℃，养晶时间2.5小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.7％(w/w)，收率49.8％，晶体无色透明，棱柱状。

实施例6：吸附层析与溶析结晶联用工艺

取按实施例1方法得到的含有布雷菲德菌素A的上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V/min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去杂质，再用4B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.08B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A纯度为91.5％，回收率为92.2％(w/w)。

上述布雷菲德菌素A粗品于常温下用适量乙醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液。以水作为反溶剂进行溶析结晶，在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶2，搅拌速度50r/min，所有反溶剂2小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物。基于HPLC分析，产物纯度99.9％(w/w)，结晶收率92.7％。综合收率85.5％。晶体无色透明，呈规则棱状(图1)。

实施例7(对比例)：吸附层析与冷却结晶联用分离效果考察

取按实施例1方法得到的含有布雷菲德菌素A的上清液，采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V./min的上柱流速，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水洗去杂质，再用4B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.08B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收溶剂，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A纯度为91.5％，回收率为92.2％(w/w)。

将上述得到的布雷菲德菌素A粗品于50℃下用适量甲醇溶解、配制布雷菲德菌素A饱和甲醇溶液，通过降温的方式进行冷却结晶。晶种投入量5mg/ml，控制降温速度为0.2℃/min，搅拌速度80r/min，出晶温度35℃，养晶时间2.5小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物，基于HPLC分析，产物纯度99.7％(w/w)，结晶收率58.4％，综合收率53.84％，晶体无色透明，长方体状(图2)。

实施例8(对比例)：溶析结晶分离效果考察

将按实施例1方法得到的上清液，于-8.0×10^-2MPa、48℃条件下，减压蒸馏回收溶剂，得到布雷菲德菌素A粗品。再于常温下用适量乙醇溶解，得到布雷菲德菌素A饱和乙醇溶液，以水作为反溶剂进行溶析结晶。在蠕动泵的控制下匀速将反溶剂水滴入至布雷菲德菌素A乙醇溶液，直至V_乙醇∶V_水＝1∶2，搅拌速度50r/min，所有反溶剂2小时滴完，养晶8小时，抽滤，得到的晶体在-9.0×10^-2MPa、20℃条件下真空干燥3小时得到产物。基于HPLC分析，产物纯度90.2％(w/w)，收率89.3％。

实施例9(对比例)：

采用CN200810163775.5的实施例4工艺中报道的蒸发结晶技术。

取按实施例1方法得到含有布雷菲德菌素A的发酵液，9000r min^-1离心10分钟，收集澄清上清液。上清液经等体积乙酸乙酯二级萃取，收集萃取相；沉淀直接采用乙酸乙酯浸提，离心收集液相。合并萃取液，水洗两次，无水硫酸钠脱水，减压蒸馏回收乙酸乙酯，得粗提取物，用丙酮溶解粗提取物，过滤。澄清滤液室温下过夜结晶，基于HPLC分析，单次蒸发结晶产物纯度82.7％(w/w)，晶体呈淡黄色，有色素残留。再进行两次重结晶(蒸发结晶)，且每次结晶母液回用分离，基于HPLC分析，产物纯度99.07％，收率69.9％；蒸发结晶制备得到的晶体晶型不规则，大小不一，晶体展开性差、倾向于堆积。

实施例10(对比例)：吸附层析与蒸发结晶联用分离效果考察

取按实施例1方法得到的含有布雷菲德菌素A发酵液上清液。采用HZ830大孔吸附树脂(上海华震科技有限公司)，以0.10B.V./min流速上样，动态吸附至饱和，先用2B.V.的水淋洗去除杂质，再用4.0B.V.的50％(v/v)乙醇水溶液，以0.08B.V./min的流速洗脱布雷菲德菌素A组分。洗脱液在-8.0×10^-2MPa、40℃条件下，经减压回收乙醇，真空浓缩，得到布雷菲德菌素A粗品。基于HPLC分析结果，布雷菲德菌素A纯度为91.5％，回收率为92.2％(w/w)。

上述布雷菲德菌素A粗品于常温下用丙酮溶解粗提取物，过滤。澄清滤液室温下过夜结晶，基于HPLC分析，单次蒸发结晶产物纯度82.7％(w/w)，晶体呈淡黄色，有色素残留；进行重结晶(蒸发结晶)，且每次结晶母液回用分离，基于HPLC分析，产物纯度99.07％，结晶收率69.9％，综合收率64.4％；蒸发结晶制备得到的晶体晶型不规则，有色素残留(图3)。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明包括将发酵液固液分离(离心、过滤)、吸附层析、溶析结晶和干燥得到布雷菲德菌素A晶体，纯度≥99％(最高可达99.9％)，溶析结晶收率≥92.3，综合收率85.5％；布雷菲德菌素A晶体纯度高(＞99％)，形状规则。本发明构思新颖、工艺简便、产物收率高、产物晶体品质高，分离操作仅使用一种环境友好的溶剂——乙醇，彻底革除有机溶剂的残留，具有较大的产业化推广价值。

一种从发酵液中分离提取高纯度布雷菲德菌素A的方法专利购买费用说明

Q：办理专利转让的流程及所需资料

A：专利权人变更需要办理著录项目变更手续，有代理机构的，变更手续应当由代理机构办理。

1：专利变更应当使用专利局统一制作的“著录项目变更申报书”提出。

2：按规定缴纳著录项目变更手续费。

3：同时提交相关证明文件原件。

4：专利权转移的，变更后的专利权人委托新专利代理机构的，应当提交变更后的全体专利申请人签字或者盖章的委托书。

Q:专利著录项目变更费用如何缴交

A：（1）直接到国家知识产权局受理大厅收费窗口缴纳,（2）通过代办处缴纳，（3）通过邮局或者银行汇款,更多缴纳方式

Q：专利转让变更，多久能出结果

A：著录项目变更请求书递交后，一般1-2个月左右就会收到通知，国家知识产权局会下达《转让手续合格通知书》。